Анализ гепатита с методом ифа

Вирусом гепатита С заражено около 170 миллионов человек по всему миру. Болезнь коварная – при смазанной симптоматике начала заболевания ее дебют проходит незамеченным. Часто развиваются хронические формы, которые приводят к разрушению клеток печени.

Исходом гепатита С становятся цирроз или рак печени. Для выявления маркеров заболевания в первую очередь назначают иммуноферментный анализ – ИФА на гепатит С.

Что такое ИФА?

Анализ основан на способности специфических антител (белков крови) связываться с антигеном (частицами вируса), при этом один из них «помечен» ферментом. Образовавшийся комплекс реагирует с подкрашенным субстратом, что фиксируется спектрофотометрическими методами.

Иммуноферментный анализ (ИФА) на гепатит С показывает не присутствие самого вируса-возбудителя в крови, а ответ иммунной системы на столкновение с ним. Количество вируса в крови на момент проведения ИФА может быть ничтожно мало, за порогом определения. А антитела – иммуноглобулины, которые выработались при встрече с «агрессором», продолжают циркулировать в кровеносной системе.

Именно присутствие антител определяется при ИФА. Появляются они в срок от нескольких дней до нескольких недель после заражения гепатитом С.

ИФА выявляет циркулирующие иммуноглобулины даже в малой концентрации. По их типу можно судить о давности заболевания. В острый период, когда вирус гепатита активно размножается, определяют иммуноглобулины класса М.

В хронической стадии (спустя 6 мес. от начала заболевания) при ИФА обнаруживают иммуноглобулины класса G. Последний тип также может свидетельствовать не о хронизации процесса, а о самом факте столкновения иммунной системы с вирусом гепатита С в прошлом.

Показания к ИФА на гепатит С

Обследование на маркеры гепатита С, к которым относятся антитела – иммуноглобулины, давно стала рутинной процедурой. ИФА назначают при:

острых и хронических заболеваниях печени;

желтухе неясного генеза;

обследовании перед хирургическими вмешательствами;

стандартном обследовании доноров крови;

постановке на учет в женской консультации при беременности. Повторно анализ сдают за 2-4 недели до предполагаемой даты родов;

прохождении гемодиализа;

профилактических осмотрах медработникам, контактирующим с компонентами крови и другими биологическими жидкостями;

незащищенном сомнительном половом контакте;

рождении детей от инфицированных матерей.

В порядке рекомендаций анализ на гепатит С назначают родственникам больного, близко с ним контактирующим. В 50% случаев парентеральный источник заражения выявить не удается. Инфекционисты предполагают бытовой путь передачи, когда зараженная кровь может попадать в кровоток здорового человека через кожные ранки и трещины. У этой версии много противников.

Как проводится анализ?

За 48 часов до ИФА исключают из пищи алкоголь, жареное, жирное и соленое. За 12 часов до забора крови из вены пациенту необходимо воздержаться от приема каких-либо лекарств. Анализ сдают утром натощак.

Наибольшее распространение получил «твердофазный» ИФА. Твердая фаза – это материал, на котором фиксируют антитела или антигены. В этом качестве используют мембраны, активно собирающие на себя белки (лабораторные планшеты, стенки пробирки, шарики и бусины из полипропилена или поливинилхлорида, нитроцеллюлозу и пр.).

Вне зависимости от разновидности ИФА, в его проведении существует строгая этапность:

На первой стадии исследуемый материал «узнается» специфическим антителом и связывается с ним, образуя иммунный комплекс;
На второй стадии с образовавшимся иммунным комплексом реагирует помеченный ферментом так называемый конъюгат – антитело или антиген;
Заключительная стадия ИФА позволяет уловить и зарегистрировать сигнал от ферментной метки.

Виды ИФА

Вариантов выполнения анализа достаточно много. Их классифицируют:

По типу реагентов, используемых на первом этапе ИФА:
a) конкурентный;
b) неконкурентный;

По степени однородности среды, в которой происходят реакции ИФА:
a) гомогенные;
b) гетерогенные;

3) По принципу определения исследуемого вещества:
a) прямой;
b) непрямой. Именно непрямой метод ИФА используется при выявлении маркеров гепатита С.

Прямой метод ИФА

При этом методе используют стандартные антитела к вирусу гепатита С, помеченные меткой – ферментом.

В лунки лабораторного планшета (если выбрали именно его в качестве твердой фазы) помещают сыворотку крови пациента. Выдерживают 20 минут, чтобы антигены (белки вируса гепатита С) успели прикрепиться к стенкам.
Добавляют стандартные помеченные ферментом антитела к гепатиту С. Выдерживают еще несколько часов – за это время образуются иммунные комплексы антиген-антитело с меткой. Чем больше антигенов в исследуемой сыворотке, тем больше таких комплексов образуется.
Содержимое лунок промывается от несвязанных белков. Затем добавляют субстрат. Это вещество при реакции с ферментом-меткой меняет цвет. Чем больше комплексов при ИФА образовалось, тем большее количество фермента может воздействовать на субстрат и тем ярче хроматографическая реакция. Она считывается ИФА-ридером и оценивается количественно.

Непрямой метод

При этом методе ИФА стандартный антиген связывается с антителами сыворотки пациента. К образовавшемуся иммунному комплексу добавляют меченые ферментом стандартные антитела к иммуноглобулинам.

В лунки лабораторного планшета помещают стандартный антиген гепатита С (частички вируса). Антиген прикрепляется к стенке, незакрепленные белки вымываются лаборантом.
В подготовленные таким образом лунки помещают исследуемый материал (сыворотку крови), инкубируют. Есть обязательные контрольные лунки со стандартными реагентами. За время инкубации образуются комплексы антиген-антитело. Непрореагировавшие компоненты опять вымывают.
В лунки добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам М и G. Эти белки прореагируют с образовавшимся ранее комплексом, только если в исследуемом образце есть антитела к гепатиту С. Промывают.
Добавляют еще один компонент – субстрат. Это химическое соединение разрушается ферментом из комплекса антиген-антитело. При этом образуется окрашенное вещество, количество которого фиксируют специальным прибором – ИФА-ридером. Чем больше фермента, тем сильнее он прореагирует с субстратом и тем ярче будет цветовой сигнал.

Расшифровка результатов

Высокая чувствительность ИФА иногда играет с пациентом злую шутку. Не каждый положительный результат означает заболевание и не каждый отрицательный – гарантия свободы от вируса.

При положительном ИФА определяют генотип вируса и определяют количество циркулирующих в крови вирусов с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Положительный

При ИФА выявляют маркеры острой фазы заболевания (иммуноглобулины класса М (IgM)) и иммуноглобулины класса G (IgG). Последние могут означать, что у пациента хронический гепатит С или то, что иммунная система хотя бы раз в прошлом сталкивалась с этим вирусом и выработался иммунитет.

Выявление одновременно двух типов иммуноглобулинов при ИФА говорит об обострении хронического гепатита С.

Отрицательный

Самый вероятный вариант – пациент не болен и его иммунная система никогда не сталкивалась с вирусом.

Псевдоотрицательный результат при ИФА можно получить в том случае, если пациент инфицировался относительно недавно и защитные антитела просто не успели выработаться. Это так называемое «диагностическое окно». Его срок – 6 месяцев.

Наконец, нельзя полностью исключить ошибку лаборатории.

Ложноположительный

ИФА реже дает погрешности по сравнению с ПЦР. Тем не менее, исследуемые вещества – белки. Реагент может связаться с неспецифическим белком сыворотки крови. Ложноположительный ИФА на гепатит С нередок в случаях:

выполненной накануне вакцинации;

при аутоиммунных патологиях или туберкулезе, рассеянном склерозе, склеродермии;

опухолевом процессе;

инфекциях, протекающих с гипертермией (грипп, ОРЗ и пр.).

Грешат ложноположительными результатами исследования на маркеры гепатита С у беременных. Довольно часто ИФА дает ложное заключение о наличии антител пациентам со II группой крови.

ИФА положительный, а ПЦР отрицательный: что это значит?

Полимеразная цепная реакция выявляет присутствие вируса в крови и его количество, помогает определить генотип. ИФА «видит» антитела – клетки, вырабатываемые спустя какое-то время после инфицирования и остающиеся в организме после уничтожения «врага».

Вариантов, при которых у пациентов с гепатитом С ПЦР отрицательный, а ИФА – положительный, два. Самый вероятный – сформировался иммунитет к вирусу, а сам он уничтожен иммунной системой или лекарствами.

Второй: нельзя исключить ошибку лаборатории при проведении ПЦР.

Диагностикой заболеваний должен заниматься врач. Он учитывает все нюансы обследования. А лабораторная диагностика, в том числе ИФА – только вспомогательный метод, не лишенный погрешностей.

Источник

Достоверность анализа

Чтобы оценить работоспособность защитных функций организма и выявить точные диагностические данные, проводят иммуноферментный анализ. В случаях инфицирования человека обнаруживаются кардинальные изменения в крови и получают результат ИФА на гепатит С положительный.

Метод изучения биологического материала ИФА относят к определению иммунохимических реакций, открывающих взаимосвязи антигенов и антител. В ходе проведения анализа к молекуле антитела химическим способом подсаживают антиген-экзим, служащий маркером, который указывает на компоненты процесса.

К компонентам иммуноферментного анализа относят:

антитела:
антитела промаркированные;
antibodies-attacking-a-virus1-440×264 антиген;
субстрат фермента;
краситель-индикатор.

Процесс выработки антител и иммуноглобулинов запускается в момент проникания в организм пациента посторонних генов или болезнетворных бактерий.

Задачей иммуноглобулинов считают нейтрализацию антигенов, происходящую при их взаимодействии. В ходе взаимодействия иммуноглобулины формируют комплект антиген-антител, которые имеют количественные и качественные характеристики. Эти значения и изучаются в процессе исследования анализа.

Для регистрации результата в ходе тестирования иммуноферментного анализа у человека забирают биологический материал. Обычно для этих целей используют венозную кровь, но в определенных ситуациях необходим анализ спинномозговой жидкости, стекловидного тела или околоплодных вод беременной женщины. Главной особенностью этого теста является его высокая достоверность, которая составляет порядка 80%.

К плюсам иммуноферментного анализа также относят:

метод ИФА превосходит прочие тесты по точности определения важных показателей в десятки раз;
для выполнения ИФА не требуется много времени, результаты, подтверждающие или опровергающие наличие вируса в организме, получают довольно быстро;
стоимость проведения ИФА доступна большинству категорий населения, в отличие от прочих тестов;
проведение ИФА дает возможность обнаружить проблему при начальных проявлениях, что значительно облегчает последующий процесс лечения человека;
все стадии проведения этого анализа автоматизированы;
высокая степень унификации теста.

К негативным проявлениям данного анализа относят возможность ложноположительных и отрицательных результатов. Сомнительные итоги могут регистрироваться при различных патологических состояниях, беременности и при употреблении медикаментозных средств, которые влияют на выработку организмом антител.

Ложноположительный результат

Вирус гепатита С

С помощью проведения иммуноферментного анализа подсчитывается количество антител к вирусу гепатита С. В ходе исследования определяется число этих образований по IgM типу, который соответствует острому течению недуга и IgG, обнаруживаемому при хронической форме.

Антитела IgM регистрируют в течение двух недель после инфицирования организма пациента вирусом гриппа С в острой форме, срок существования этих образований от 3 до 5 месяцев.

Антитела IgG вырабатываются спустя несколько месяцев после поражения организма, но их существование подтверждается в течение десяти лет, даже при условии полного выздоровления пациента.

Отрицательный результат тестирования дает возможность утверждать, что антитела обоих типов отсутствуют в организме и на данный момент гепатит С не обнаружен. Следует учитывать, что если человек заразился в течение последних двух недель, определение патологии невозможно.

Положительный результат теста показывает наличие того или иного типа антител в организме пациента. Данный показатель характеризует инфицирование гепатитом С в острой или хронической форме. Следует учитывать, что фиксация этих образований не дает возможность однозначно указывать на заражение человека, вполне допустимо, что он является только носителем. Бывают случаи, когда при расшифровке данных фиксируется ложноположительный результат.

Это происходит в результате фиксирования лабораторными приборами антител, которые производятся защитной системой человека в ответ на следующие патологии:

аутоиммунное воспаление;
проникновение в организм пациента прочих инфекций;
при беременности.

Статистика проведения иммуноферментного исследования показывает, что ложноположительный вывод регистрируется в 15% всех результатов, подтверждающих наличие вируса. Для беременных женщин данный показатель еще выше.

Причины ложноположительных результатов

Недостоверный вывод тестирования на гепатит С выявляется при сбоях функционирования внутренних органов и технических сбоев, то есть халатного отношения медицинского персонала к своим обязанностям. Ошибки обнаруживаются не более чем в 15% случаев, но их можно избежать, выполняя следующие правила:

Перед сдачей анализа нельзя курить

для сдачи анализа необходимо выбирать только проверенные, сертифицированные лаборатории с обученным медицинским персоналом;
накануне проведения анализов следует прекратить употребление любых медикаментозных препаратов, если прием лекарства обусловлен состоянием пациента, он должен предупредить персонал лаборатории об этом факте;
процедура обычно проводится утром натощак, но перед этим пациенту не следует проявлять излишнюю физическую активность и курить;
непосредственно перед проведением анализа рекомендуется определить температуру тела, она не должна превышать норму.

При сомнении в правильности выводов тестирования, назначается повторный анализ. В идеале требуется проведение трех исследований биологического материала на гепатит С.

Если первый тест показал наличие антител в крови пациента, а последующие два не выявили эти образования, можно утверждать, что инфицирования организма вирусом гепатита С нет. Существует ряд заболеваний, которые влияют на результат тестирования крови на наличие вируса гепатита С.

https://youtu.be/WckrECLnx3I

Некоторые патологии сопровождаются выработкой антител, и в этом случае подтверждение наличия вируса гепатита С в организме пациента производится с помощью других методов исследования, так как многократно повторяющиеся ошибки при ИФА анализе не дают гарантии правильного диагноза.

Комплексное изучение с применением исследования биологического материала человека в лабораторных условиях и с использованием инструментальных методов позволит выявить истинную причину недомогания, и исключить гепатит С.

Чаще всего причиной ложноположительного результата анализа являются следующие патологии:

инфекционные заболевания острого или хронического типа;
рак или доброкачественные новообразования во внутренних органах;
заболевания аутоиммунного типа, при течении которых образуются антитела к собственным клеткам организма пациента;
туберкулез;
малярия;
склеродермия;
герпес;
рассеянный склероз;
артрит.

Все перечисленные заболевания являются причиной возникновения сбоев в иммунной системе человека, в результате чего иммуноглобулины начинают вырабатываться с превышением нормы, что и становится помехой для постановки точного диагноза и подтверждения наличия вируса гепатита С в организме пациента.

После соприкосновения с источником инфекции организм человека может успешно подавить воспаление, но антитела, при проведении ИФА, все еще обнаруживались в крови, что стало причиной ложноположительного результата теста.

Довольно часто такой результат тестирования регистрируется у беременных женщин, поэтому без повторного анализа, подтверждение заболевания у такого пациента, не проводится.

Причиной отклонений от нормы становится изменения в организме женщины, которая ждет ребенка. В этот период у нее происходит перестройка внутренних органов, что выражается в следующих процессах:

изменяется гормональный фон;
в крови формируются специфические белки, вследствие чего меняется ее состав;
уровень цитокинов увеличивается.

Помимо перечисленных факторов, влияющих на итоги иммуноферментного анализа, нужно отметить ошибки медицинского персонала, приводящие к обнаружению ложноположительных выводов тестирования:

недостаточная квалификация персонала, проводящего забор биологического материала;
сбои в функционировании лабораторного оборудования;
подмена проб по халатности;
ненадлежащее хранение биологического материала (нарушение температурного режима).

При проведении иммуноферментного анализа следует учитывать, что пациент мог недавно получить прививку против гриппа, гепатита или столбняка. Этот факт нужно обязательно довести до сведения лечащего врача или медицинского персонала в лаборатории, чтобы была назначена другая дата исследования.

Что делать, если результат положительный

Регистрация антител в биологическом материале пациента, указывающая на присутствие вируса гепатита С в организме, не всегда является окончательным диагнозом заболевания. Ложноположительные результаты иммуноферментного анализа нередки, и повторные тесты часто опровергают первоначальные выводы.

При положительных анализах нужно обратиться к гепатологу

Нужно понимать, что ИФА тест дает возможность выявить количественные и качественные изменения в биологическом материале человека и определить характер течения заболевания. Делать окончательное заключение об инфицировании гепатитом С можно только после комплексного изучения состояния пациента с применением других лабораторных и инструментальных исследований.

Если положительный результат выявлен надлежащим образом, человеку следует отправиться к специалистам: инфекционисту и гепатологу. Только профильный врач сможет определить, какие тесты необходимо пройти дополнительно до назначения курса терапии

По данным медицинской статистики, в мире инфицировано гепатитом С почти 4% населения, но этот показатель явно занижен, так как многие носители недуга не подозревают о своей проблеме. Поэтому проведение ИФА теста в качестве профилактической меры поможет выявить заболевание на начальной стадии и быстро справиться с болезнью.

Источник