Анализ воды на гепатит а
Изобретение относится к эпидемиологии вирусного гепатита, в частности выделению вируса гепатита А из объектов окружающей среды, а именно из воды . Целью изобретения является повышение степени выявления вируса гепатита А в больших объемах воды разной степени загрязненности, упрощение и удешевление способа Дляэтого адсорбцию вируса гепатита А из подкисленной соляной кислотой до уровнярН ,5 анализируемой пробыосуществляютн,-; кристаллическом гидрате окиси алюминия в форме гицраргиллита с последующей элюцией 0,05 М глицериновым буфером рН 11,5,нейтрализацией до уровня рН 7,0- 8,0, проведения антимикробной обработки хлороформом, концентрацию и анализ на наличие специфической антигенной активности при помощи ИФ. 1 табл. , 1 ил. с С
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (19) (11) (g1)g, 01 N 33/18
00ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ CCCP
t(21 ) 4753028/13 (22) 25.10 .89 (46) 23.05,92.Бюл, Ь» 19 (71) Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) А,Н, Бурков, MÄ. 1, Алейник, К.В„ Блохин и С,В. Зубов (53) 578.8,.094,29(088.8) (56) 4ortins И.T,, Nargues E,, Soare s Ь .А., «А compa ra t ive study of
methods for concentrations of human
entегоviruses йrom Sewage», Nator, Sc i
and Technol., 1982, v. 14, .N 4-5, р. 273-279.
Брок Т. мембранная фильтрация, И, Нир, 1987, с. 462.
Красильников И.В., Казанцева В.А,, Иванова 0.Е. и др, Выделение вирусов из воды с использованием пористого кремнеземов, — Вопросы вирусологии, 1985, т, 30, Н 5, с, 608-610, Изобретение относится к эпидемиологии вирусного гепатита А, в частности выделению вируса гепатита A из объектов окружающей среды, а именно воды, Известен способ анализа воды на содержание вирусов, основанный на пропускании воды через мембранные фильтры (1): Данный способ .заключается в адсорбции вирусов на мембране с размером пор порядка 0,Ц5 мкм с последующей их десорбцией, Известен также способ анализа воды на содержание вирусов, основанный на адсорбции виру» сов на пористых кремнеземах 1 2) ., Не2 (54) СПОСОБ АНАЛИЗА ВОДЫ НА СОДЕРЖАНИЕ ВИРУСА ГЕПАТИТА А (57) Изобретение относится к эпидемиологии вирусного гепатита, в частности выделению вируса гепатита А из объектов окружающей среды, а именно из во,ды, Целью изобретения является повышение степени выявления вируса гепатита A в больших объемах воды разной степени загрязненности, упрощение и удешевление способа. Для этого адсорбцию вируса гепатита A из подкисленной соляной кислотой до уровня рН 3, 0-4, 5 анализируемой пробыосуществляютн» кристаллическом гидрате окиси алюминия в форме гицраргиллита с последующей элюцией 0,05 M глицериновым буфером рН
19
11,5 нейтрализацией до уровня рН 7,0- g/
ЪД (8,0, проведения антимикробной обработки хлороформом, концентрацию и анализ на наличие специфической антигенной активности при помощи ИФА. 1 табл., 1 ил. достатком описанных способов анализа воды на содержание вирусов является: для первого способа — необходимость наличия специального дорогостоящего ,оборудования и материалов (микрофильтры), для второго использование для анализа лишь небольших объемов (до
10 л) вирусосодержащей жидкости, что резко снижает потенциальные возможности метода, Наиболее близким по технической сущности и ожидаемому положительному эффекту к предлагаемому изобретению является способ анализа воды на налиЭ 17357 чие энтеровирусов, основанный на адсорбции их на аморфном осадке гидрата окиси алюминия (31 .
Авторами был воспроизведен данный способ применительно к анализу раэли чных видов воды на содержание вируса гепатита А, Способ заключается в следующем, В и ри г отовле нные модел ь ные растворы с известным содержанием ви10 руса гепатита А вносят аморфный Гидрат окиси алюминия, доводят рН др уровня 3,0-4,5 соляной кислотой и при перемешивании инкубируют в течение ночи, Осадок отделяют низкоскоростным центрифугированием. Злюцию вируса îñóf5 ществляют 0,05 М глициновым буфером рН 11,5, нейтрализуют рН 7,0-8,0
0,05 М глициновым буфером рН 1,5, проводят антимикробную обработку хлоро- формом, концентрируют ультрафильтрацией до минимального объема и анализируют на наличие специфической антигенной активности вируса гепатита А при помощи иммуноферментного анализа (ИФА), Однако к недостаткам этого способа относится: невысокая степень выявления вируса гепатита А, которая составляет в среднем 20-25 ; от внесенного количества и воэможность осуществлять анализ» небольших объемов жидкости, поскольку возникают технологические трудности в выделении осадка, Целью изобретения является повышение степени выявления вируса гепати- З5 та A в больших объемах воды разной степени загрязненности и его упрощение.
Поставленная цель достигается тем, что вместо аморфного гидрата окиси 40 алюминия для адсорбции вируса гепатита А из воды используют кристалличес.кий гидрат окиси алюминия в форме гидраргиллита„.
Способ осуществляют следующим об- 45 разом.
Анализируемую воду подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4,5 и пропускают через одну или несколько колонок, заполненных кристаллическим Я гидратом окиси алюминия из расчета см > на 10 л анализируемой воды со скоростью 1,0-20 мл/мин, элюцию проводят 0,05 t1 глициновым буфером рН
11,5, нейтрализуют рН до 7,0-8,0 55
0,05 М глициновым буфером рН i,5, затем осуществляют антимикробную обработку хлороформом, доводят объем элю67 4 ата ультрафильтрацией до нескольких миллилитров и анализируют на наличие специфической антигенной активности вируса гепатита А при помощи ИфА, Способ поясняется следующими примерами, Пример 1. Питьевую воду объемом 10 л с внесенным в нее культуральным вирусом гепатита А (штамм НА
15) в концентрации в 1000 раз меньше минимально детектируемой методом ИФА, подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4,5 и пропускают через колонку с кристаллическим гидратом окиси алюминия объемом 1 смз со скоростью
10-20 мл/мин, После прохождения воды через колонку пропускают десорбирующий 0,05 М глициновый буфер рН 11,0„
Злюат нейтрализуют до уровня рН 7,00,0, используя 0,05 М глициновый буфер рН 1,5, проводят антимикробную обра» ботку хлороформом, концентрируют ультрафильтрацией до конечног0 объема
5 мл и анализируют на наличие специфической активности при помощи ИФА.
Проводят количественное определение антигена вируса гепатита А, которое в данном случае составляет 983 от внесенного.
Пример 2, Проведение анализа осуществляют как в примере 1, за ис — ключением того, что вместо культурального вируса гепатита А (штамм НА — 15) используют «дикий» вирус, выделенный от больного вирусным гепатитом A.
Результаты полностью идентичны полученным с использованием культурального вируса, Пример 3. Проведение анализа осуществляют, как в примере 1, за исключением того, что для проведения анализа используют сточную воду, Количественное содержание нтигена вируса гепатита А, определяемое при помощи
ИФА, составляет в данном случае 80
90;; от внесенного количества, I
Пример 4, Сточную воду объемом 1 л с внесенным в нее вирусом гепатита А в концентрации в 100 раз меньше минимально детектируемой методом ИФА подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4.5 и пропускают через колонку с кристаллическим гидратом окиси алюминия с различной скоростью
Установлено, что сорбционная емкость гидрата окиси алюминия была максимальной и оставалась неизменной при
Наименование десорбирующего буфера
Показатели экстинкции
0fl 492 нм
Процент
«выхода» вируса
0>576
0,5 М трис буфера рН 8 5
0,5 М фосфатный буфер рН 8,2
70,0
34,0
О, 281
5 1 735767 б скорости пропускания сточной воды че- используя 0,05 глициновый буфер рез колонку от 1 до 20,0 мл/мин, Яаль», pal 1,5. нейшее увеличение скорости лимитиро- Злюаты с колонок объединяют и провалось гидравлическим сопротивлением изводят антимикробную обработку хлоро и забиванием колонки взвешенными в формом, концентрируют ультрафильтрасточной воде твердыми частицами, цией до конечного объема 5 мл и анали
П р и и е р 5, Проведение анализа зируют на наличие специфической антиосуществляют, как в примере 3, но . генной активности при помощи ИФА, Ан« анализируемую сточную воду перед про- тиген вируса гепатита А был определен пусканием через колонку с кристалли- в разведении 1:8, Кроме того, часть ческим гидратом окиси алюминия не элюата после дополнительного освобожподкисляют, Установлено снижение выхо- дения от контаминирующей бактериальда вируса до 50;;, ной флоры при помощи стерилизующей
Оптимальную адсорбцию получают при фильтрации была использована для эараl5 значениях рН между 3,0-4,5 (см.черт.) . .жения культуры клеток FrHK-4, После
Пример 6. Проведение анализа . трек пассажей вирус гепатита A был обосуществляют, как в примере 1 за ис- наружен при помощи ИФА. Наличие вируса ключением операции элюирования, кото- гепатита А подтвердили, используя рую проводят с использованием различ- О непрямой иммунофлюоресцентный метод. ных десорбирующих буферов. В таблице использование предложенного cnocoba приведены результаты использования позволит увеличить степень выявления в качестве десорбирующих буферов вируса гепатита А, которая не зависит
0,5 М три — буфера с рН 8 56; 0.,5 М от вида и степени загрязненности анафосфатного буфера с рН 8,Z; 3ь мясным лизируемой воды по сравнению с иээкстрактом с рН 9,0; 0,05 глициновым вест ным способом, а та кже — эна чи- . буфером с рН 11,5. тельно упростить анализ эа счет исПредставленные в таблице реэульта ключения этапа низкоскоростного центты свидетельствуют, что наилучшие ре- рифугирования, воэможности использовазультаты получают при использовании в ния простейшего оборудования отечесткачестве десорбирующего О;05 М глици- венного производства, нового буфера с рН 11, 5.
П ример 7, Сточную воду объе- Формула изобретения мом 30 мл отобранную из канализацион- ного коллектора детского дошкольного Способ анализа воды на содержание учреждения по эпидемическим показа- gg вируса гепатита А путем пропускания ниям (зарегистрировано несколько слу- воды через колонку с сорбентом, провечаев заболеваний вирусным гепати- дение элюции, очистки от микрофлоры том А), подкисляют соляной кислотой . и определения в элюате специфической до уровня рН 3,0-4,5 и пропускают че- вирусной активности при помощи ИФА, реэ две колонки с кристаллическим гид» 40 отличающийся тем, что, с ратом окиси алюминия общим объемом целью повышения степени выявления ви20 см со скоростью 5-20 мл/мин„Пос- руса гегатита А и его упрощения, в
3 ле прохождения воды пропускают де- качестве сорбента используют кристалсорбирующий 0,05 М глициновый буфер лический гидрат окиси алюминия в фор11,5, нейтрализуют до уровня 7,0-8.0, 45 ме гидраргиллита.
Изучение эффективности десорбции вируса гепатита
А с кристаллического гидрата окиси алюминия в зависимости от используемого буфера
1735767
Продолжение таблицы
3 мясной экстракт рН 9,0
0,05 1 глициновый буфер рН 11,5
91,0
0,752
98,0
0,810
Примечание: объем элюата во всех случаях был одинаков и равнялся 5 мл.
Ацс орбцкя вируса,/ I
-s0
2 4 6 8 IO pH
Составитель А, Бурков
Техред ц,дицык Корректор Л. Пилипенко
Редактор А, Зробок
З 1ЕЛ Тираж . Подписное
ВНИИПИ Госуцарственного комитета о изобретенилм и открытилм при ГЕНТ СССР
113035, Иосква, 3-35, Рауаекал наб., д. 4/S
Производственно-издательский комбинат «Патент», г. Ужгород, уп. Гагарина, 101
Источник
Гепатит А коварен тем, что заразившийся представляет угрозу для окружающих последние пять дней инкубационного периода, когда заболевание протекает в скрытой форме. Люди с хорошим иммунитетом переносят болезнь Боткина легко, без желтушности, при этом так же активно высевают вирус, по нескольку миллиардов в сутки, для заражения хватит 100 особей.
По симптомам заболевания печени схожи с проявлениями ОРВИ, поэтому присутствие в крови патогена заподозрить всё-таки можно, особенно если был контакт с выявленным больным, или человек находился в зоне возможного поражения. Вирус гепатита А живуч, длительное время живет на поверхностях, к которым прикасался больной, в воде он спокойно существует до 10 месяцев.
Показатели крови меняются, если печень поражена. Выявить присутствие патогена помогает анализ на гепатит А. По результатам несложно установить факт заражения. Специальные маркеры определяют в крови вирусы гепатита А, антигены к заболеванию, их концентрацию. Исследования проводятся в диагностических и профилактических целях, в первую очередь обследуют людей группы риска.
Какие анализы крови сдаются на гепатит А?
На нарушения работы печени указывают отклонения некоторых показателей от нормы общего анализа крови, когда кровь берут из пальца. При воспалительном процессе любой этиологии изменяется скорость осаждения эритроцитов.
Развернутую картину состояния здоровья позволяют получить биохимические исследования проб, взятых из вены. Например, билирубин: по его концентрации судят о присутствии патологических изменений в паренхиме. На заболевание указывают сразу несколько показателей. Но установить факт заражения по биохимическому анализу нельзя.
Вирус гепатита А выявляется по ферментам, которые организм начинает выделять, когда патоген попадает в гепатоциты. С большой точностью определяют гепатит А анализы:
- Anti-HAV-IgG на наличие анител класса IgG, они появляются в крови когда организм начинает противостоять вирусу гепатита А и после прививок, когда вырабатывается иммунитет;
- Anti-HAV-IgM выявляет антитела класса IgM, их количество возрастает в период заболевания, резко снижается при выздоровлении;
- тест на РНК-вирус, этот генетический анализ проводится методом ПЦР (полимеразная цепная реакция), исследуется сыворотка крови.
Кому необходимо сдавать анализы?
Существует утвержденный Минздравом список лиц, которые регулярно проходят обследования, это:
- сотрудники медицинских учреждений;
- кадровый состав и учащиеся образовательных учреждений (детских садов, школ, специализированных учебных заведений);
- специалисты, контактирующие с неорганизованными детьми в группах их дневного пребывания;
- работники интернатов;
- люди, занятые в сфере торговли, общепита, переработки продуктов питания;
- военнослужащие и гражданские лица, служащие в исправительных учреждениях.
Кровь на гепатит А сдают:
- беженцы;
- лица, находящиеся в очаге возможного заражения (когда выявляются случаи заболевания, обследуют родственников заразившегося, соседей, коллег по работе или учебе);
- люди, устраивающиеся на работу в детские учреждения, школы, другие предприятия, где требуется санитарная книжка;
- сотрудники, выезжающие в командировки в страны с высоким уровнем заболеваемости гепатитом;
- туристы, посещающие страны Ближнего востока, Африки;
- люди, проживающие в районах, где канализационные стоки попали в питьевой водоем, вышла из строя система хозпитьевого водоснабжения.
В группе риска находятся и другие категории граждан, которым рекомендуется анализ крови на гепатит:
- люди, пренебрегающие правилами личной гигиены;
- любители орального секса, гомосексуалисты;
- асоциальные элементы, проживающие в антисанитарных условиях;
- жильцы общежитий, сотрудники учреждений, контактирующие с большим числом посетителей.
ИФА на гепатит А
От болезни Боткина нет лекарственных средств, больному снимают интоксикацию, поддерживают защитные функции организма. Иммунитет самостоятельно вырабатывает антитела или они вводятся в процессе вакцинации. Они бывают двух типов, сначала появляются антивирусы IgM, затем IgG. Определяются они иммуноферментным анализом Anti-HAV.
Как оцениваются результаты исследований:
- при отсутствии возбудителя в крови не обнаруживаются АНТИ-HAV IgM, АНТИ-HAV IgG;
- когда вырабатывается иммунитет, у человека отрицательный результат теста АНТИ-HAV IgM, положительный на присутствие IgG-антител;
- если в крови одновременно есть антигены IgM и IgG, организм заражен вирусом гепатита А.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Качественную и количественную оценку вируса гепатита А позволяет получить анализ методом ПЦР. Ген в специальной питательной среде с содержанием особых ферментов заставляют искусственно размножаться, чтобы затем определить генотип вируса: 1а, 1b или 1с. Существует два типа анализа ПЦР:
- качественный определяет наличие штамма в крови, положительный ПЦР говорит о заболевании,
- отрицательный ПЦР у здоровых людей;
- количественный анализ позволяет определить концентрацию вируса, этот показатель характеризует степень опасности инфицированного для окружающих.
Метод ПЦР выявляет заболевание на ранних стадия, когда нет внешних проявлений желтухи. Когда гепатит А протекает в латентной форме, вовремя выявить вирус гепатита А очень важно, распространение болезни происходит молниеносно, особенно в контактных группах. Изолировав больного, можно предотвратить эпидемию.
Общий (клинический) анализ крови
Результаты помогают в постановке предварительного анализа, у больного снижается уровень гемоглобина, меняется показатель свертываемости – уровень тромбоцитов падает, количество эритроцитов увеличивается, лейкоциты, наоборот, быстро разрушаются.
Каких-то характерных изменений при гепатите А в анализе не выявляется. Можно судить только об интоксикации, ухудшении состояния здоровья зараженного. Такая клиническая картина характерна для многих заболеваний.
Отклонения от норм являются поводом проводить дальнейшие исследования. Какие показатели общего анализа крови при гепатите А считаются нормальными, указано в таблице.
Результаты ОАК при гепатите А
Показатель (концентрация стандартная, указанная в бланках) | Возрастная группа: дети до 3 лет | Возрастная группа: дети от 3 до 12 лет | Возрастная группа: лица, старше 12 лет |
| уровень лейкоцитов | 6–17 | 5–11 | 4–9,5 |
| количество лимфоцитов | 2–9,5 | 2–9,5 | 1–5 |
| концентрация эритроцитов | 1–12 | 1–12 | 1–15 |
| уровень тромбоцитов | 100–450 | 100–450 | 180–400 |
| СОЭ (скорость осаждения эритроцитов) | 4–8 | 4–12 | 2–20 |
Биохимический анализ крови
Венозная кровь исследуется после проведения общего анализа крови или одновременно с ним. При попадании вируса меняется белковый состав крови, концентрация микроэлементов. По биохимии можно судить о патологических процессах в печени, есть показатели, отклонение от нормы которых характерны только для пораженной паренхимы.
На что обращают внимание в анализе на гепатит А (расшифровка показателей):
- Концентрация билирубина (нормой считается 20,5 мкмоль/л), он утилизируется здоровыми клетками печени. Если орган работает не в полной мере, вещество накапливается в крови, в результате у человека желтеют склеры, глазные яблоки, кожа.
- Показатель АЛТ, (у здорового человека он в пределах 500 МЕ/л), при заболевании печени концентрация достигает 3000 МЕ/л, чем больше степень поражения паренхимы, тем выше концентрация белка АЛТ или АЛаТ.
- Уровень АСТ (норма 34-41 МЕ/л), когда этот белок хуже выводится из организма, концентрация его в крови возрастает. Одной из причин плохой утилизации является инфекционное поражение печени.
- Общий белок (у взрослых людей его должно быть не меньше 65 г/л, не больше 84 г/л), отклонение от нормы в любую сторону говорят о патологии, при воспалительных процессах в организме, в том числе и в печени, норма общего белка превышена.
- Альбумин (нормой считается концентрация в диапазоне 35–50 г/л), он ферментируется печенью, если паренхима поражена, уровень альбумина падает. Этот показатель очень характерен для гепатита А, так как вирус гепатита А заселяется в гепатоциты, уничтожает их. Некротические клетки в дальнейшем вызывают воспаление. По снижению альбумина можно заподозрить заболевание на ранних стадиях и при латентной форме течения.
Как сдавать анализы на гепатиты?
Точность исследований напрямую зависит от подготовки пациента к взятию проб. Речь идет не только сдаче анализа на голодный желудок. За сутки до забора крови людям с подозрениями на гепатит А не рекомендуется:
- употреблять жирную пищу;
- есть консервации и салаты с большим содержанием уксуса;
- исключить специи, особенно с желчегонными свойствами;
- отказаться от употребления спитросодержащих напитков любой крепости;
- снизить по минимума прием медикаментов, исключить БАДы, витаминные комплексы, на лекарства от диабета, гипертонии, сердечных заболеваний запрет не распространяется.
За 8 часов до анализов необходимо полностью отказаться от еды. При выполнении этих правил пациентом результаты исследований будут отражать реальную картину состояния его здоровья.
Сколько делается анализ на гепатит А?
Существуют специальные правила забора крови, ее транспортировки в лабораторию, в них же указывается, сколько времени делают анализ на гепатит А. Для проведения общего анализа крови требуется до 2 рабочих дня, превышение этого срока считается нарушением. Обычно результаты готовы уже к вечеру. Для проведения биохимического анализа отводится неделя.
Методы, требующие предварительной подготовки биологических жидкостей, оттягивают процесс получения результатов, сроки их получения могут затягиваться 10 дней.
Существуют методы экспресс-тестирования, когда забор крови производится для определения одного из показателей.
Источник
