Ифа и рнк антитела гепатит
Вирусом гепатита С заражено около 170 миллионов человек по всему миру. Болезнь коварная – при смазанной симптоматике начала заболевания ее дебют проходит незамеченным. Часто развиваются хронические формы, которые приводят к разрушению клеток печени.
Исходом гепатита С становятся цирроз или рак печени. Для выявления маркеров заболевания в первую очередь назначают иммуноферментный анализ – ИФА на гепатит С.
Что такое ИФА?
Анализ основан на способности специфических антител (белков крови) связываться с антигеном (частицами вируса), при этом один из них «помечен» ферментом. Образовавшийся комплекс реагирует с подкрашенным субстратом, что фиксируется спектрофотометрическими методами.
Иммуноферментный анализ (ИФА) на гепатит С показывает не присутствие самого вируса-возбудителя в крови, а ответ иммунной системы на столкновение с ним. Количество вируса в крови на момент проведения ИФА может быть ничтожно мало, за порогом определения. А антитела – иммуноглобулины, которые выработались при встрече с «агрессором», продолжают циркулировать в кровеносной системе.
Именно присутствие антител определяется при ИФА. Появляются они в срок от нескольких дней до нескольких недель после заражения гепатитом С.
ИФА выявляет циркулирующие иммуноглобулины даже в малой концентрации. По их типу можно судить о давности заболевания. В острый период, когда вирус гепатита активно размножается, определяют иммуноглобулины класса М.
В хронической стадии (спустя 6 мес. от начала заболевания) при ИФА обнаруживают иммуноглобулины класса G. Последний тип также может свидетельствовать не о хронизации процесса, а о самом факте столкновения иммунной системы с вирусом гепатита С в прошлом.
Показания к ИФА на гепатит С
Обследование на маркеры гепатита С, к которым относятся антитела – иммуноглобулины, давно стала рутинной процедурой. ИФА назначают при:
- острых и хронических заболеваниях печени;
- желтухе неясного генеза;
- обследовании перед хирургическими вмешательствами;
- стандартном обследовании доноров крови;
- постановке на учет в женской консультации при беременности. Повторно анализ сдают за 2-4 недели до предполагаемой даты родов;
- прохождении гемодиализа;
- профилактических осмотрах медработникам, контактирующим с компонентами крови и другими биологическими жидкостями;
- незащищенном сомнительном половом контакте;
- рождении детей от инфицированных матерей.
В порядке рекомендаций анализ на гепатит С назначают родственникам больного, близко с ним контактирующим. В 50% случаев парентеральный источник заражения выявить не удается. Инфекционисты предполагают бытовой путь передачи, когда зараженная кровь может попадать в кровоток здорового человека через кожные ранки и трещины. У этой версии много противников.
Как проводится анализ?
За 48 часов до ИФА исключают из пищи алкоголь, жареное, жирное и соленое. За 12 часов до забора крови из вены пациенту необходимо воздержаться от приема каких-либо лекарств. Анализ сдают утром натощак.
Наибольшее распространение получил «твердофазный» ИФА. Твердая фаза – это материал, на котором фиксируют антитела или антигены. В этом качестве используют мембраны, активно собирающие на себя белки (лабораторные планшеты, стенки пробирки, шарики и бусины из полипропилена или поливинилхлорида, нитроцеллюлозу и пр.).
Вне зависимости от разновидности ИФА, в его проведении существует строгая этапность:
- На первой стадии исследуемый материал «узнается» специфическим антителом и связывается с ним, образуя иммунный комплекс;
- На второй стадии с образовавшимся иммунным комплексом реагирует помеченный ферментом так называемый конъюгат – антитело или антиген;
- Заключительная стадия ИФА позволяет уловить и зарегистрировать сигнал от ферментной метки.
Виды ИФА
Вариантов выполнения анализа достаточно много. Их классифицируют:
- По типу реагентов, используемых на первом этапе ИФА:
a) конкурентный;
b) неконкурентный;
- По степени однородности среды, в которой происходят реакции ИФА:
a) гомогенные;
b) гетерогенные;
- 3) По принципу определения исследуемого вещества:
a) прямой;
b) непрямой. Именно непрямой метод ИФА используется при выявлении маркеров гепатита С.
Прямой метод ИФА
При этом методе используют стандартные антитела к вирусу гепатита С, помеченные меткой – ферментом.
- В лунки лабораторного планшета (если выбрали именно его в качестве твердой фазы) помещают сыворотку крови пациента. Выдерживают 20 минут, чтобы антигены (белки вируса гепатита С) успели прикрепиться к стенкам.
- Добавляют стандартные помеченные ферментом антитела к гепатиту С. Выдерживают еще несколько часов – за это время образуются иммунные комплексы антиген-антитело с меткой. Чем больше антигенов в исследуемой сыворотке, тем больше таких комплексов образуется.
- Содержимое лунок промывается от несвязанных белков. Затем добавляют субстрат. Это вещество при реакции с ферментом-меткой меняет цвет. Чем больше комплексов при ИФА образовалось, тем большее количество фермента может воздействовать на субстрат и тем ярче хроматографическая реакция. Она считывается ИФА-ридером и оценивается количественно.
Непрямой метод
При этом методе ИФА стандартный антиген связывается с антителами сыворотки пациента. К образовавшемуся иммунному комплексу добавляют меченые ферментом стандартные антитела к иммуноглобулинам.
- В лунки лабораторного планшета помещают стандартный антиген гепатита С (частички вируса). Антиген прикрепляется к стенке, незакрепленные белки вымываются лаборантом.
- В подготовленные таким образом лунки помещают исследуемый материал (сыворотку крови), инкубируют. Есть обязательные контрольные лунки со стандартными реагентами. За время инкубации образуются комплексы антиген-антитело. Непрореагировавшие компоненты опять вымывают.
- В лунки добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам М и G. Эти белки прореагируют с образовавшимся ранее комплексом, только если в исследуемом образце есть антитела к гепатиту С. Промывают.
- Добавляют еще один компонент – субстрат. Это химическое соединение разрушается ферментом из комплекса антиген-антитело. При этом образуется окрашенное вещество, количество которого фиксируют специальным прибором – ИФА-ридером. Чем больше фермента, тем сильнее он прореагирует с субстратом и тем ярче будет цветовой сигнал.
Расшифровка результатов
Высокая чувствительность ИФА иногда играет с пациентом злую шутку. Не каждый положительный результат означает заболевание и не каждый отрицательный – гарантия свободы от вируса.
При положительном ИФА определяют генотип вируса и определяют количество циркулирующих в крови вирусов с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Положительный
При ИФА выявляют маркеры острой фазы заболевания (иммуноглобулины класса М (IgM)) и иммуноглобулины класса G (IgG). Последние могут означать, что у пациента хронический гепатит С или то, что иммунная система хотя бы раз в прошлом сталкивалась с этим вирусом и выработался иммунитет.
Выявление одновременно двух типов иммуноглобулинов при ИФА говорит об обострении хронического гепатита С.
Отрицательный
Самый вероятный вариант – пациент не болен и его иммунная система никогда не сталкивалась с вирусом.
Псевдоотрицательный результат при ИФА можно получить в том случае, если пациент инфицировался относительно недавно и защитные антитела просто не успели выработаться. Это так называемое «диагностическое окно». Его срок – 6 месяцев.
Наконец, нельзя полностью исключить ошибку лаборатории.
Ложноположительный
ИФА реже дает погрешности по сравнению с ПЦР. Тем не менее, исследуемые вещества – белки. Реагент может связаться с неспецифическим белком сыворотки крови. Ложноположительный ИФА на гепатит С нередок в случаях:
- выполненной накануне вакцинации;
- при аутоиммунных патологиях или туберкулезе, рассеянном склерозе, склеродермии;
- опухолевом процессе;
- инфекциях, протекающих с гипертермией (грипп, ОРЗ и пр.).
Грешат ложноположительными результатами исследования на маркеры гепатита С у беременных. Довольно часто ИФА дает ложное заключение о наличии антител пациентам со II группой крови.
ИФА положительный, а ПЦР отрицательный: что это значит?
Полимеразная цепная реакция выявляет присутствие вируса в крови и его количество, помогает определить генотип. ИФА «видит» антитела – клетки, вырабатываемые спустя какое-то время после инфицирования и остающиеся в организме после уничтожения «врага».
Вариантов, при которых у пациентов с гепатитом С ПЦР отрицательный, а ИФА – положительный, два. Самый вероятный – сформировался иммунитет к вирусу, а сам он уничтожен иммунной системой или лекарствами.
Второй: нельзя исключить ошибку лаборатории при проведении ПЦР.
Диагностикой заболеваний должен заниматься врач. Он учитывает все нюансы обследования. А лабораторная диагностика, в том числе ИФА – только вспомогательный метод, не лишенный погрешностей.
Источник
В настоящее время заражение HCV-инфекцией приобретает масштабы эпидемии. Если раньше заболевание считали проблемой определенных социально неблагополучных категорий населения (наркоманов, женщин и мужчин, предоставляющих/пользующихся сексуальными услугами), сейчас заразиться можно во время эстетических манипуляций, в кабинете у стоматолога и т.д. Поэтому ранняя диагностика вируса, включая анализ на антитела к гепатиту С, приобретает все большее клиническое значение.
Патология опасна скрытым течением. При одном из самых распространенных генотипов HCV – 1b заболевание быстро переходит в хроническую форму, не проявляя при этом специфических симптомов. Лишь у небольшой части пациентов возникает астенический синдром, непереносимость физических нагрузок, возможно периодическое повышение температуры до субфебрильных цифр. Часто подобные признаки списывают на переутомление или ОРВИ.
Доктора нередко сталкиваются со случаями, когда положительные результаты анализов на вирус обнаруживаются в ходе профилактического скрининга (например, на этапе подготовки к беременности или постановке на учет в женской консультации, оформлении медицинских документов и т.д.).
Современные технологии позволяют выявить гепатит Ц на ранних стадиях, через несколько недель после заражения. Это улучшает прогноз развития заболевания, предупреждает поражение тканей печени и внутренних органов.
Специалисты рекомендуют регулярно проверяться на HCV. Сдать необходимые исследования можно либо по направлению от терапевта, либо в любой частной лаборатории. Одним из предлагаемых исследований является ИФА – иммуноферментный анализ, задача которого выявить специфические антитела (АТ) к вирусу гепатита С. Данный тест отличается высокой чувствительностью и служит основой для дальнейших диагностических мероприятий.
Что такое антитела к гепатиту С в крови?
Чтобы разобраться в вопросе, что это значит, антитела к вирусу гепатита С, следует кратко остановиться на механизме формирования иммунного ответа. Это соединения белковой структуры, которые при проникновении патогена в организм вырабатываются на поверхности определенного вида лимфоцитов и попадают в системный кровоток. Основная функция антител состоит в связывании с вирусом, препятствуя проникновению в клетку и последующей репликации.
У человека обнаружены пять групп антител (их также именуют иммуноглобулинами – Ig):
- тип А – вырабатываются вскоре после инфицирования и постепенно исчезают по мере устранения патогенной флоры (в результате иммунной активности или соответствующей терапии);
- тип М – выделяются в острой фазе течения инфекции, обнаруживаются и при активизации хронического патологического процесса;
- тип G – составляют более 70% от общей массы иммуноглобулинов человека, «отвечают» за формирование вторичного иммунного ответа;
- тип D – выявлен сравнительно недавно, функции практически не изучены;
- тип Е – выделяется при развитии аллергической реакции в ответ на попадание специфического раздражителя (аллергена).
Для диагностики гепатита C решающую роль играет наличие антител класса М и G. Положительный анализ методом ИФА не означает 100% диагноза гепатита C. Определение суммарных антител (М + G) – начальный этап диагностического процесса. В дальнейшем для подтверждения инфицирования проверяют наличие и фактический уровень РНК HCV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
По результатам анализа ИФА доктор может определить, является ли человек носителем вируса, либо заболевание прогрессирует и требует немедленной терапии. Случаи самоизлечения и отсутствие поражений печени является результатом полноценной работы иммунной системы и активной выработки АТ, которые останавливают развитие вирусной инфекции. Именно в таком случае антитела к гепатиту С есть, а ПЦР отрицательный.
Подобную картину отмечают, если АТ обнаружены у ребенка. Обычно это происходит, если беременная женщина была инфицирована вирусом, либо получала соответствующую терапию до зачатия. При соблюдении необходимых мер профилактики и защиты от заражения, АТ исчезнут в 12–18 месяцев.
Виды антител
В клинической практике из всех разновидностей иммуноглобулинов у человека, значение имеют только два вида – IgM и IgG. Первые активно вырабатываются вскоре после проникновения патогена в клетки организма, вторые свидетельствуют о длительном, хроническом течении заболевания.
Однако современные методы диагностики позволили расширить спектр определяемых ИФА антител:
| Anti-HCV IgG | Положительный результат свидетельствует о хроническом течении заболевания, при отрицательном ПЦР возможно самоизлечение |
| Core-Ag HCV | Core — часть структуры генома HCV. Появление АТ указывает на недавнее заражение и острое течение инфекции |
| Anti-HCV суммарный (total) | Указывает на общий уровень АТ в организме человека. Позитивный результат сохраняется на протяжении всей жизни вне зависимости от ответа на лечение |
| Anti-HCVNS(3, 4, 5) | Позволяет определить стадию и тяжесть патологии. АТ к NS3 выявляют сразу после заражения. АТ к NS4 указывает на тяжесть нарушений работы печени. АТ к NS 5 демонстрирует хроническое, упорное течение |
Из перечисленных исследований на практике реально применяют только три: Anti-HCV IgG, Core Ag (антиген) и суммарный Anti-HCV. Последний анализ на антитела к структурным белкам финансово затратен, поэтому назначается только в критических случаях (например, необъяснимая резистентность к терапии, рецидив и т.д.).
Через какое время возможно выявление антител
Процесс выработки антител в значимых концентрациях в среднем занимает несколько недель. Однако в зависимости от того, какой обнаруживается маркер, возможно определение стадии и степени тяжести HCV-инфекции.
Предполагаемые сроки выявления АТ представлена в таблице:
| Тип серологического исследования | Приблизительное время определения методом ИФА |
| Общий Anti–HCV | На 4–6 неделе после инфицирования |
| Core-Ag HCV | Может определяться уже через несколько дней после заражения (при высокой чувствительности тест-систем). Однако подобная методика не получила распространения из-за высокой стоимости. Чаще проводится в комплексе с выявлением IgG к гепатиту С |
| Anti-HCV IgG | На 9–12 неделе после проникновения вируса в организм |
| Антитела к структурным белкам | Можно выявить позже всех выделяющихся АТ |
Тест, предполагающий выявление антител гепатита С, лучше проводить по назначению врача. В отличие от качественного ПЦР, в результатах которого указан однозначный вывод – обнаружен в организме HCV или нет, профессионально расшифровать данные серологического исследования может только специалист.
В зависимости от того, когда появляются те или иные антитела, доктор подбирает оптимальную схему терапии. Резистентные и хронические формы патологии часто требуют не только применения комбинации современных противовирусных препаратов, но и дополнительного назначения Рибавирина и/или Интерферонов пролонгированного действия (ПЕГ-ИФН).
Анализ ПЦР и ИФА: этапы диагностирования вируса
В настоящее время существуют два основных метода выявления HCV-инфекции:
- серологические анализы (ИФА) – выявление специфических антител к HCV (anti-hcv);
- молекулярно-биологические исследования, обнаруживающие РНК вируса (качественная и количественная ПЦР, генотипирование).
Двойная диагностика исключает риск ложноположительной, как и ложноотрицательной реакции. При выявлении anti-hcv с помощью ИФА доктор рекомендует исследование ПЦР (сначала качественное, затем количественное).
Но иногда результаты обследования являются противоречивыми, и ответ на вопрос, что значит, антитела к гепатиту С обнаружены, а ПЦР отрицательная, зависит от ряда факторов.
Методика расшифровки результатов ПЦР и ИФА приведена в таблице.
| Данные Anti-HCV и HCV РНК | Предполагаемый диагноз |
| +/+ | Острая или хроническая фаза HCV (требует дополнительной диагностики) |
| +/- | Острое течение HCV, когда произошло выделение АТ, но РНК вируса в крови не обнаруживается. Такие же результаты возможны в период после перенесенного острого гепатита С |
| -/+ |
|
| -/- | Отсутствие гепатита С |
Обнаружение антигенов гепатита
Первичная лабораторная диагностика HCV начинается с определения основного маркера инфицирования – антител к антигенам вируса гепатита С. Они начинают появляться практически сразу после заражения, но в терапевтически значимых концентрациях обнаруживаются спустя несколько недель. Наличие АТ свидетельствует о перенесенном или текущем вирусе (при положительном результате ПЦР).
ИФА проводится при помощи высокочувствительных современных, но в то же время финансово доступных тест-систем 2 и 3 поколения. Подобные наборы реагентов основаны на захвате специфических к HCV антител рекомбинантными белками, а затем определении вторичных АТ против IgG или IgM. Эти антитела помечены ферментами, катализирующими проведение реакции.
ИФА тест-системы II поколения помимо обнаружения основных АТ способны обнаружить антитела против эпитопов, полученных из участка core и неструктурных белков (NS3, NS4). Таким образом достигается высокая чувствительность исследования и низкая вероятность ложных результатов. При помощи таких тестов HCV можно обнаружить через 2,5 месяца после заражения.
ИФА – системы III поколения разработаны на основе антигена структурного протеина NS5 и высокоиммуногенного эпитопа NS3. Подобная методика позволяет существенно сократить время от попадания вируса в организм до выработки антител.
Обнаружение IgM недостаточно для выявления острого или хронического течения HCV, так как у некоторых пациентов при длительном течении заболевания регулярно вырабатываются IgM, но в то же время не все больные «отвечают» на острую форму заболевания выделением IgM.
Вероятность ложноположительных результатов (впоследствии отмечают исчезновение АТ) возрастает при:
- беременности;
- аутоиммунных патологиях;
- положительных ревмопробах и др.
Возможность ложноотрицательных результатов присутствует при:
- регулярном проведении гемодиализа;
- ВИЧ;
- злокачественных поражениях системы кроветворения.
Считается, что при HCV-инфекции одного ИФА недостаточно, так как АТ появляются не сразу. Кроме того, всегда присутствует вероятность ложных результатов. Поэтому обязательным в диагностике гепатита С является дополнительное проведение качественной и количественной ПЦР.
Носитель HCV
Некоторые гепатологи считают, что такого термина, как «носитель HCV» не существует, человек или болен гепатитом С, или нет. Иногда подобный диагноз ставят при выявлении в крови антител к HCV, но отрицательном результате ПЦР.
Подобная ситуация возможна в нескольких случаях:
- пренатальный контакт с вирусом, АТ в крови ребенка сохраняются до 1,5–3 лет, затем отмечают, что они просто пропали;
- перенесенная острая форма HCV, которая либо проходит без симптомов, либо протекает с вариабельной клинической картиной.
В любом случае эта проблема требует постоянного наблюдения врача. Обязательна ПЦР, ее повторяют регулярно (раз в несколько месяцев) и проведение других диагностических мероприятий. Также необходимо исключить состояния, повышающие риск ложноположительного результата ИФА.
Почему после лечения антитела остаются
При проведении контрольных анализов после окончания противовирусной терапии многих пациентов интересует вопрос, когда исчезают АТ и надолго остаются ли антитела после лечения гепатита С. Доктора предупреждают, что IgG могут циркулировать в крови несколько лет, однако их уровень должен постепенно снижаться.
При проведении исследование методом ИФА на выявление суммарных антител, также возможен положительный результат. Но в таком случае требуется дифференцировать IgG и IgM. Обнаружение последних говорит в пользу рецидива заболевания и требует срочного начала дополнительного курса медикаментозного лечения оставшейся в организме инфекции.
В норме после лечения гепатита С остаются IgG.
Суммарные антитела
Анализ на суммарные антитела к вирусу гепатита С выявляет общее количество иммуноглобулинов без их дифференцировки – IgG + IgM. В бланках лабораторий такое исследование часто называют Anti-HCV Total. Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии заболевания (за исключением отдельных случаев). Положительный результат требует дальнейшей диагностики.
Пациенту назначают:
- ПЦР (сначала качественную, затем количественную);
- дифференцированную серодиагностику (анализ для выявления титров IgG и IgM по отдельности);
- ультразвуковое исследование печени;
- печеночные пробы;
- анализ на сопутствующие заболевания (ВИЧ, аутоиммунные патологии, расстройства кроветворения и иммунной функции).
Окончательный диагноз врач ставит только после получения всех результатов. Также обращают внимание на анамнез. Прохождение противовирусной терапии обязательно только после достоверного подтверждения наличия вируса в крови.
Если суммарное определение АТ к HCV не укладывается в общепринятые нормы показано дальнейшее обследование. Начало лечения без дополнительных исследований противопоказано.
Расшифровка результата анализа
Как правило, в бланке анализа на антитела к вирусу гепатита С приведены результаты и норма параметров. При некоторых типах исследований пишут титр АТ.
| Данные анализа | Предполагаемое состояние пациента |
| Anti-HCV суммарные положительные (с указанием титра) |
|
| Anti-HCV суммарные отрицательные |
|
| Обнаружен IgM (с указанием титра), IgG отрицательный | Начало развития инфекции (недавнее заражение) |
| Выявление IgG (с указанием титра), IgM отрицательный |
|
| Выявлены и IgG и IgM | Рецидив хронического заболевания |
Расшифровкой показателей ИФА должен заниматься только врач. Самолечение по результатам одного или нескольких исследований противопоказано.
Пациенты из группы риска
Регулярно проводить серологическое исследование на выявление маркеров гепатита С необходимо определенной категории людей:
- работникам медицинских учреждений;
- с диагностированным ВИЧ;
- при подготовке и в период беременности;
- после полового акта с носителем вируса;
- больным с онкологическими патологиями крови;
- при неразборчивости в сексуальных контактах.
Также в категорию риска попадают люди, пристрастившиеся к инъекционным наркотическим препаратам, постоянно контактирующие с носителем вируса (например, муж/жена больны HCV). Но врачи-гепатологи обращают внимание пациентов на возможность ложных показателей исследования, что требует комплексной диагностики.
Источник
