Иммуноферментный анализ крови при гепатите

Иммуноферментный анализ – это метод диагностики вирусных заболеваний. ИФА на гепатит С показывает реакцию иммунной системы на действие патогенных микроорганизмов. Для процедуры используют венозную кровь и ищут в ней антитела к вирусу гепатита. Иммуноферментный анализ недорогой, выполняется быстро, но требует подтверждения повторным ИФА или более дорогим ПЦР.

Сущность и достоверность метода

Метод основан на способности антител (клеток иммунной системы) образовывать комплексы с частицами вируса гепатита (антигенами). Для определения этих комплексов пользуются специальными маркерными ферментами. Анализ дает возможность выявить количество антител к вирусу в первые 6-12 недель болезни.

Подготовка к ИФА включает:

• исключение физических нагрузок за сутки до исследования;
• запрет на употребление алкогольных напитков, табачных изделий и жирной пищи;
• временное прекращение приема лекарственных препаратов и оральных контрацептивов.

Кровь для иммуноферментного анализа на гепатит берут утром натощак. Достоверность данного метода повышается при повторном проведении ИФА спустя 2 недели после процедуры.

Результат анализа показывает:

1. уровень эффективности работы иммунной системы при борьбе с вирусом;
2. стадию заболевания;
3. течение – острый или хронический гепатит.

Женщинам в период беременности необходимо сдать кровь на ИФА минимум два раза:

• на ранних сроках (4-5 недель);
• перед родами;

Преимущества ИФА заключаются в:

• доступной стоимости анализа для всего населения;

• полной автоматизации процесса, исключающей ошибку человека;

• быстром получении результата анализа;

• возможности выявить инфекционное заболевание на ранних этапах;

• высокой точности.

Показания к ИФА на гепатит С

Гепатит С – опасное вирусное заболевание, которое передается через кровь и разрушает клетки печени.

Показания к анализу крови на ВГС:

• наличие ВИЧ-инфекции;
• симптомы острого гепатита: рвота, вялость, чувство горечи во рту, отсутствие аппетита, желтушный цвет кожных покровов и др.;
• хронический гепатит;
• наличие в биохимическом анализе крови повышенного билирубина и изменение коэффициента де Ритиса (указывают на нарушения работы печени);
• принадлежность к группе риска (врачи, медсестры, наркозависимые);
• наркотическая и алкогольная зависимость.

Проверку на гепатит С обязаны проходить военные, сотрудники правоохранительных органов, работники общепита и социальных служб.

Какие антитела обнаруживает тест

Анализ на гепатит С, проведенный методом ИФА, способен обнаружить антитела двух типов:

1. IgM;
2. IgG.

IgM – иммуноглобулин, имеющий самую крупную молекулярную массу и неспособный проникать через плацентарный барьер. Антитела класса IgM вырабатываются в организме первыми – спустя 6 недель после заражения. Через полгода уровень иммуноглобулинов типа М снижается и остается таким до следующего рецидива болезни (при хроническом гепатите). Иммуноглобулины M являются основой первичного иммунного ответа зараженного организма.

IgG – основной иммуноглобулин сыворотки крови, является вторичным иммунным ответом. Обеспечивает иммунитет ребенка, рожденного от инфицированной матери. Иммуноглобулины G вырабатываются спустя 3 месяца после возникновения заболевания, достигают максимальной концентрации на пятом месяце и остаются в этом количестве на протяжении многих лет.

В периоде острого вирусного гепатита есть две стадии. На первой происходит активация и выделение IgM, на второй – IgG. В острой фазе болезни IgM и IgG образуются к нуклеокапсидному белку вируса Core. При латентном (скрытом) течении вырабатываются IgG к белку core и неструктурному белку NS.

Способы проведения

Диагностика гепатита включает два способа проведения ИФА – прямой и непрямой.

Прямой

Прямой метод ИФА на антитела к гепатиту С основан на образовании комплексов антиген-антитело.

Стадии проведения:

1. В специальную таблицу с лунками заносят биологический материал пациента (кровь) и оставляют на 30 минут. Важные элементы приклеиваются ко дну лунок. 
2. Добавляют специальные меченые антитела. Они прикрепляются к антителам исследуемой крови (если такие есть). Здесь выжидают несколько часов. 
3. Содержимое лунок сливают и промывают от лишних веществ.
4. В каждую лунку добавляют ферменты, которые распознают добавленные ранее антитела. Ферменты связаны со специальным маркером.
5. При положительной реакции маркерное вещество становится окрашенным.

Эта методика включает несколько простых шагов и обеспечивает достоверный результат.

Непрямой

Непрямой метод ИФА отличается тем, что в системе участвуют не два, а три компонента.

Он включает два варианта:

• Конкурирующий: в исследуемую систему добавляют антигены, кровь пациента, в которой предполагается наличие иммуноглобулинов, и антитела, помеченные ферментом. Две группы антител вступают в борьбу за образование комплексов с антигеном. Положительной реакция считается при максимальном количестве антител первой группы и минимальном – второй группы.
• Сэндвич-ИФА: в лунки заносят антитела к исследуемому антигену, после чего добавляют кровь и новые антитела. Исследуемый антиген оказывается между двумя молекулами иммуноглобулинов. Этот «сэндвич» виден визуально или при подсвечивании специальным спектром.

Расшифровка анализа

Существует четыре варианта расшифровки анализа:

1. Положительный результат. В исследуемом материале обнаружены IgM и IgG к вирусу гепатита – означает, что человек заражен давно (более 3 месяцев назад). Если обнаружены только IgM, то инфекция попала в кровь месяц назад, если только IgG – произошло выздоровление или хронизация гепатита.
2. Отрицательный результат. Иммуноглобулинов в исследуемой крови не обнаружено. Человек полностью здоров.
3. Ложноположительный результат. ИФА всегда нужно проверять полимеразной цепной реакцией (выявляет сам вирус в крови или печеночной ткани). Если ПЦР дает отрицательный результат, то ИФА следует провести заново.
4. Сомнительный результат. Если прошло очень мало времени после рискованной ситуации, ИФА может не выявить наличия антител. Для подтверждения результата необходимо провести повторный анализ через две недели.

Ложноположительный и ложноотрицательный результаты ИФА могут возникнуть вследствие ошибки в лаборатории или неправильной подготовке к анализу. У беременных ложные результаты встречаются чаще, чем у остальных людей.

Почему ИФА положительный, а ПЦР отрицательная

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – дополнительный метод диагностики вирусных заболеваний. Выявляет РНК вируса, то есть его генетическую информацию, применяется для подтверждения диагноза. В некоторых случаях ПЦР дает отрицательный результат при положительном показателе ИФА.

Почему так происходит:

• Выздоровление: ПЦР реагирует только на РНК вируса гепатита, а ИФА может дать положительный результат и после выздоровления, ведь он выявляет клетки иммунной системы, которые сохраняются в крови на несколько лет.
• Разный исследуемый материал: при заборе из разной локализации может возникнуть несоответствие результатов. Так, для ПЦР берут не только кровь, но и кусочек ткани печени.
• Разные тестовые системы. 

Что покажет ИФА после лечения гепатита

После пройденной терапии против гепатита С необходимо еще раз сдать кровь на ИФА.

Иммуноглобулины G сохраняются в организме несколько лет после выздоровления, поэтому повторный анализ на гепатит может быть положительным. В этом случае необходимо дополнительно сдать кровь на ПЦР. Отрицательный результат ПЦР на гепатит будет свидетельством того, что человек здоров, а положительный – подтвердит ИФА и укажет на некачественное лечение.

Отрицательный результат повторного ИФА является подтверждением выздоровления.

ИФА относится к лабораторным методам высокой точности и позволяет выявить заболевание на ранних сроках. При первых симптомах гепатита нужно срочно обратиться к врачу, который назначит необходимые анализы для подтверждения диагноза.

Если у вас так же обнаружен РНК гепатита С в крови (вирусная нагрузка), рекомендуем ознакомиться с материалом по расшифровке анализов при гепатите С.

Вирусом гепатита С заражено около 170 миллионов человек по всему миру. Болезнь коварная – при смазанной симптоматике начала заболевания ее дебют проходит незамеченным. Часто развиваются хронические формы, которые приводят к разрушению клеток печени.

Исходом гепатита С становятся цирроз или рак печени. Для выявления маркеров заболевания в первую очередь назначают иммуноферментный анализ – ИФА на гепатит С.

Что такое ИФА?

Анализ основан на способности специфических антител (белков крови) связываться с антигеном (частицами вируса), при этом один из них «помечен» ферментом. Образовавшийся комплекс реагирует с подкрашенным субстратом, что фиксируется спектрофотометрическими методами.

Иммуноферментный анализ (ИФА) на гепатит С показывает не присутствие самого вируса-возбудителя в крови, а ответ иммунной системы на столкновение с ним. Количество вируса в крови на момент проведения ИФА может быть ничтожно мало, за порогом определения. А антитела – иммуноглобулины, которые выработались при встрече с «агрессором», продолжают циркулировать в кровеносной системе.

Именно присутствие антител определяется при ИФА. Появляются они в срок от нескольких дней до нескольких недель после заражения гепатитом С.

ИФА выявляет циркулирующие иммуноглобулины даже в малой концентрации. По их типу можно судить о давности заболевания. В острый период, когда вирус гепатита активно размножается, определяют иммуноглобулины класса М.

В хронической стадии (спустя 6 мес. от начала заболевания) при ИФА обнаруживают иммуноглобулины класса G. Последний тип также может свидетельствовать не о хронизации процесса, а о самом факте столкновения иммунной системы с вирусом гепатита С в прошлом.

Показания к ИФА на гепатит С

Обследование на маркеры гепатита С, к которым относятся антитела – иммуноглобулины, давно стала рутинной процедурой. ИФА назначают при:

• острых и хронических заболеваниях печени;

• желтухе неясного генеза;

• обследовании перед хирургическими вмешательствами;

• стандартном обследовании доноров крови;

• постановке на учет в женской консультации при беременности. Повторно анализ сдают за 2-4 недели до предполагаемой даты родов;

• прохождении гемодиализа;

• профилактических осмотрах медработникам, контактирующим с компонентами крови и другими биологическими жидкостями;

• незащищенном сомнительном половом контакте;

• рождении детей от инфицированных матерей.

В порядке рекомендаций анализ на гепатит С назначают родственникам больного, близко с ним контактирующим. В 50% случаев парентеральный источник заражения выявить не удается. Инфекционисты предполагают бытовой путь передачи, когда зараженная кровь может попадать в кровоток здорового человека через кожные ранки и трещины. У этой версии много противников.

Как проводится анализ?

За 48 часов до ИФА исключают из пищи алкоголь, жареное, жирное и соленое. За 12 часов до забора крови из вены пациенту необходимо воздержаться от приема каких-либо лекарств. Анализ сдают утром натощак.

Наибольшее распространение получил «твердофазный» ИФА. Твердая фаза – это материал, на котором фиксируют антитела или антигены. В этом качестве используют мембраны, активно собирающие на себя белки (лабораторные планшеты, стенки пробирки, шарики и бусины из полипропилена или поливинилхлорида, нитроцеллюлозу и пр.).

Вне зависимости от разновидности ИФА, в его проведении существует строгая этапность:

1. На первой стадии исследуемый материал «узнается» специфическим антителом и связывается с ним, образуя иммунный комплекс;
2. На второй стадии с образовавшимся иммунным комплексом реагирует помеченный ферментом так называемый конъюгат – антитело или антиген;
3. Заключительная стадия ИФА позволяет уловить и зарегистрировать сигнал от ферментной метки.

Виды ИФА

Вариантов выполнения анализа достаточно много. Их классифицируют:

• По типу реагентов, используемых на первом этапе ИФА:
  a) конкурентный;
  b) неконкурентный;

• По степени однородности среды, в которой происходят реакции ИФА:
  a) гомогенные;
  b) гетерогенные;

• 3) По принципу определения исследуемого вещества:
  a) прямой;
  b) непрямой. Именно непрямой метод ИФА используется при выявлении маркеров гепатита С.

Прямой метод ИФА

При этом методе используют стандартные антитела к вирусу гепатита С, помеченные меткой – ферментом.

1. В лунки лабораторного планшета (если выбрали именно его в качестве твердой фазы) помещают сыворотку крови пациента. Выдерживают 20 минут, чтобы антигены (белки вируса гепатита С) успели прикрепиться к стенкам.
2. Добавляют стандартные помеченные ферментом антитела к гепатиту С. Выдерживают еще несколько часов – за это время образуются иммунные комплексы антиген-антитело с меткой. Чем больше антигенов в исследуемой сыворотке, тем больше таких комплексов образуется.
3. Содержимое лунок промывается от несвязанных белков. Затем добавляют субстрат. Это вещество при реакции с ферментом-меткой меняет цвет. Чем больше комплексов при ИФА образовалось, тем большее количество фермента может воздействовать на субстрат и тем ярче хроматографическая реакция. Она считывается ИФА-ридером и оценивается количественно.

Непрямой метод

При этом методе ИФА стандартный антиген связывается с антителами сыворотки пациента. К образовавшемуся иммунному комплексу добавляют меченые ферментом стандартные антитела к иммуноглобулинам.

1. В лунки лабораторного планшета помещают стандартный антиген гепатита С (частички вируса). Антиген прикрепляется к стенке, незакрепленные белки вымываются лаборантом.
2. В подготовленные таким образом лунки помещают исследуемый материал (сыворотку крови), инкубируют. Есть обязательные контрольные лунки со стандартными реагентами. За время инкубации образуются комплексы антиген-антитело. Непрореагировавшие компоненты опять вымывают.
3. В лунки добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам М и G. Эти белки прореагируют с образовавшимся ранее комплексом, только если в исследуемом образце есть антитела к гепатиту С. Промывают.
4. Добавляют еще один компонент – субстрат. Это химическое соединение разрушается ферментом из комплекса антиген-антитело. При этом образуется окрашенное вещество, количество которого фиксируют специальным прибором – ИФА-ридером. Чем больше фермента, тем сильнее он прореагирует с субстратом и тем ярче будет цветовой сигнал.

Расшифровка результатов

Высокая чувствительность ИФА иногда играет с пациентом злую шутку. Не каждый положительный результат означает заболевание и не каждый отрицательный – гарантия свободы от вируса.

При положительном ИФА определяют генотип вируса и определяют количество циркулирующих в крови вирусов с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Положительный

При ИФА выявляют маркеры острой фазы заболевания (иммуноглобулины класса М (IgM)) и иммуноглобулины класса G (IgG). Последние могут означать, что у пациента хронический гепатит С или то, что иммунная система хотя бы раз в прошлом сталкивалась с этим вирусом и выработался иммунитет.

Выявление одновременно двух типов иммуноглобулинов при ИФА говорит об обострении хронического гепатита С.

Отрицательный

Самый вероятный вариант – пациент не болен и его иммунная система никогда не сталкивалась с вирусом.

Псевдоотрицательный результат при ИФА можно получить в том случае, если пациент инфицировался относительно недавно и защитные антитела просто не успели выработаться. Это так называемое «диагностическое окно». Его срок – 6 месяцев.

Наконец, нельзя полностью исключить ошибку лаборатории.

Ложноположительный

ИФА реже дает погрешности по сравнению с ПЦР. Тем не менее, исследуемые вещества – белки. Реагент может связаться с неспецифическим белком сыворотки крови. Ложноположительный ИФА на гепатит С нередок в случаях:

• выполненной накануне вакцинации;

• при аутоиммунных патологиях или туберкулезе, рассеянном склерозе, склеродермии;

• опухолевом процессе;

• инфекциях, протекающих с гипертермией (грипп, ОРЗ и пр.).

Грешат ложноположительными результатами исследования на маркеры гепатита С у беременных. Довольно часто ИФА дает ложное заключение о наличии антител пациентам со II группой крови.

ИФА положительный, а ПЦР отрицательный: что это значит?

Полимеразная цепная реакция выявляет присутствие вируса в крови и его количество, помогает определить генотип. ИФА «видит» антитела – клетки, вырабатываемые спустя какое-то время после инфицирования и остающиеся в организме после уничтожения «врага».

Вариантов, при которых у пациентов с гепатитом С ПЦР отрицательный, а ИФА – положительный, два. Самый вероятный – сформировался иммунитет к вирусу, а сам он уничтожен иммунной системой или лекарствами.

Второй: нельзя исключить ошибку лаборатории при проведении ПЦР.

Диагностикой заболеваний должен заниматься врач. Он учитывает все нюансы обследования. А лабораторная диагностика, в том числе ИФА – только вспомогательный метод, не лишенный погрешностей.