Исследования на вирусные гепатиты методом ифа

Вирусом гепатита С заражено около 170 миллионов человек по всему миру. Болезнь коварная – при смазанной симптоматике начала заболевания ее дебют проходит незамеченным. Часто развиваются хронические формы, которые приводят к разрушению клеток печени.

Исходом гепатита С становятся цирроз или рак печени. Для выявления маркеров заболевания в первую очередь назначают иммуноферментный анализ – ИФА на гепатит С.

Что такое ИФА?

Анализ основан на способности специфических антител (белков крови) связываться с антигеном (частицами вируса), при этом один из них «помечен» ферментом. Образовавшийся комплекс реагирует с подкрашенным субстратом, что фиксируется спектрофотометрическими методами.

Иммуноферментный анализ (ИФА) на гепатит С показывает не присутствие самого вируса-возбудителя в крови, а ответ иммунной системы на столкновение с ним. Количество вируса в крови на момент проведения ИФА может быть ничтожно мало, за порогом определения. А антитела – иммуноглобулины, которые выработались при встрече с «агрессором», продолжают циркулировать в кровеносной системе.

Именно присутствие антител определяется при ИФА. Появляются они в срок от нескольких дней до нескольких недель после заражения гепатитом С.

ИФА выявляет циркулирующие иммуноглобулины даже в малой концентрации. По их типу можно судить о давности заболевания. В острый период, когда вирус гепатита активно размножается, определяют иммуноглобулины класса М.

В хронической стадии (спустя 6 мес. от начала заболевания) при ИФА обнаруживают иммуноглобулины класса G. Последний тип также может свидетельствовать не о хронизации процесса, а о самом факте столкновения иммунной системы с вирусом гепатита С в прошлом.

Показания к ИФА на гепатит С

Обследование на маркеры гепатита С, к которым относятся антитела – иммуноглобулины, давно стала рутинной процедурой. ИФА назначают при:

• острых и хронических заболеваниях печени;

• желтухе неясного генеза;

• обследовании перед хирургическими вмешательствами;

• стандартном обследовании доноров крови;

• постановке на учет в женской консультации при беременности. Повторно анализ сдают за 2-4 недели до предполагаемой даты родов;

• прохождении гемодиализа;

• профилактических осмотрах медработникам, контактирующим с компонентами крови и другими биологическими жидкостями;

• незащищенном сомнительном половом контакте;

• рождении детей от инфицированных матерей.

В порядке рекомендаций анализ на гепатит С назначают родственникам больного, близко с ним контактирующим. В 50% случаев парентеральный источник заражения выявить не удается. Инфекционисты предполагают бытовой путь передачи, когда зараженная кровь может попадать в кровоток здорового человека через кожные ранки и трещины. У этой версии много противников.

Как проводится анализ?

За 48 часов до ИФА исключают из пищи алкоголь, жареное, жирное и соленое. За 12 часов до забора крови из вены пациенту необходимо воздержаться от приема каких-либо лекарств. Анализ сдают утром натощак.

Наибольшее распространение получил «твердофазный» ИФА. Твердая фаза – это материал, на котором фиксируют антитела или антигены. В этом качестве используют мембраны, активно собирающие на себя белки (лабораторные планшеты, стенки пробирки, шарики и бусины из полипропилена или поливинилхлорида, нитроцеллюлозу и пр.).

Вне зависимости от разновидности ИФА, в его проведении существует строгая этапность:

1. На первой стадии исследуемый материал «узнается» специфическим антителом и связывается с ним, образуя иммунный комплекс;
2. На второй стадии с образовавшимся иммунным комплексом реагирует помеченный ферментом так называемый конъюгат – антитело или антиген;
3. Заключительная стадия ИФА позволяет уловить и зарегистрировать сигнал от ферментной метки.

Виды ИФА

Вариантов выполнения анализа достаточно много. Их классифицируют:

• По типу реагентов, используемых на первом этапе ИФА:
  a) конкурентный;
  b) неконкурентный;

• По степени однородности среды, в которой происходят реакции ИФА:
  a) гомогенные;
  b) гетерогенные;

• 3) По принципу определения исследуемого вещества:
  a) прямой;
  b) непрямой. Именно непрямой метод ИФА используется при выявлении маркеров гепатита С.

Прямой метод ИФА

При этом методе используют стандартные антитела к вирусу гепатита С, помеченные меткой – ферментом.

1. В лунки лабораторного планшета (если выбрали именно его в качестве твердой фазы) помещают сыворотку крови пациента. Выдерживают 20 минут, чтобы антигены (белки вируса гепатита С) успели прикрепиться к стенкам.
2. Добавляют стандартные помеченные ферментом антитела к гепатиту С. Выдерживают еще несколько часов – за это время образуются иммунные комплексы антиген-антитело с меткой. Чем больше антигенов в исследуемой сыворотке, тем больше таких комплексов образуется.
3. Содержимое лунок промывается от несвязанных белков. Затем добавляют субстрат. Это вещество при реакции с ферментом-меткой меняет цвет. Чем больше комплексов при ИФА образовалось, тем большее количество фермента может воздействовать на субстрат и тем ярче хроматографическая реакция. Она считывается ИФА-ридером и оценивается количественно.

Непрямой метод

При этом методе ИФА стандартный антиген связывается с антителами сыворотки пациента. К образовавшемуся иммунному комплексу добавляют меченые ферментом стандартные антитела к иммуноглобулинам.

1. В лунки лабораторного планшета помещают стандартный антиген гепатита С (частички вируса). Антиген прикрепляется к стенке, незакрепленные белки вымываются лаборантом.
2. В подготовленные таким образом лунки помещают исследуемый материал (сыворотку крови), инкубируют. Есть обязательные контрольные лунки со стандартными реагентами. За время инкубации образуются комплексы антиген-антитело. Непрореагировавшие компоненты опять вымывают.
3. В лунки добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам М и G. Эти белки прореагируют с образовавшимся ранее комплексом, только если в исследуемом образце есть антитела к гепатиту С. Промывают.
4. Добавляют еще один компонент – субстрат. Это химическое соединение разрушается ферментом из комплекса антиген-антитело. При этом образуется окрашенное вещество, количество которого фиксируют специальным прибором – ИФА-ридером. Чем больше фермента, тем сильнее он прореагирует с субстратом и тем ярче будет цветовой сигнал.

Расшифровка результатов

Высокая чувствительность ИФА иногда играет с пациентом злую шутку. Не каждый положительный результат означает заболевание и не каждый отрицательный – гарантия свободы от вируса.

При положительном ИФА определяют генотип вируса и определяют количество циркулирующих в крови вирусов с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Положительный

При ИФА выявляют маркеры острой фазы заболевания (иммуноглобулины класса М (IgM)) и иммуноглобулины класса G (IgG). Последние могут означать, что у пациента хронический гепатит С или то, что иммунная система хотя бы раз в прошлом сталкивалась с этим вирусом и выработался иммунитет.

Выявление одновременно двух типов иммуноглобулинов при ИФА говорит об обострении хронического гепатита С.

Отрицательный

Самый вероятный вариант – пациент не болен и его иммунная система никогда не сталкивалась с вирусом.

Псевдоотрицательный результат при ИФА можно получить в том случае, если пациент инфицировался относительно недавно и защитные антитела просто не успели выработаться. Это так называемое «диагностическое окно». Его срок – 6 месяцев.

Наконец, нельзя полностью исключить ошибку лаборатории.

Ложноположительный

ИФА реже дает погрешности по сравнению с ПЦР. Тем не менее, исследуемые вещества – белки. Реагент может связаться с неспецифическим белком сыворотки крови. Ложноположительный ИФА на гепатит С нередок в случаях:

• выполненной накануне вакцинации;

• при аутоиммунных патологиях или туберкулезе, рассеянном склерозе, склеродермии;

• опухолевом процессе;

• инфекциях, протекающих с гипертермией (грипп, ОРЗ и пр.).

Грешат ложноположительными результатами исследования на маркеры гепатита С у беременных. Довольно часто ИФА дает ложное заключение о наличии антител пациентам со II группой крови.

ИФА положительный, а ПЦР отрицательный: что это значит?

Полимеразная цепная реакция выявляет присутствие вируса в крови и его количество, помогает определить генотип. ИФА «видит» антитела – клетки, вырабатываемые спустя какое-то время после инфицирования и остающиеся в организме после уничтожения «врага».

Вариантов, при которых у пациентов с гепатитом С ПЦР отрицательный, а ИФА – положительный, два. Самый вероятный – сформировался иммунитет к вирусу, а сам он уничтожен иммунной системой или лекарствами.

Второй: нельзя исключить ошибку лаборатории при проведении ПЦР.

Диагностикой заболеваний должен заниматься врач. Он учитывает все нюансы обследования. А лабораторная диагностика, в том числе ИФА – только вспомогательный метод, не лишенный погрешностей.

Антиген «s» вируса гепатита В (HBsAg)

Поверхностный антиген гепатита В в сыворотке крови в норме отсутствует.
Обнаружение поверхностного антигена (HBsAg) гепатита В в сыворотке подтверждает острое или хроническое инфицирование вирусом гепатита В.

При остром заболевании HBsAg выявляется в сыворотке крови в последние 1-2 недели инкубационного периода и первые 2-3 недели клинического периода. Циркуляция HBsAg в крови может ограничиваться несколькими днями, поэтому следует стремиться к раннему первичному обследованию больных. Метод ИФА позволяет выявить HBsAg более чем у 90% больных. Почти у 5% больных самые чувствительные методы исследования не обнаруживают HBsAg, в таких случаях этиология вирусного гепатита В подтверждается наличием анти-HBсAg JgM или ПЦР.

Концентрация HBsAg в сыворотке крови при всех формах тяжести гепатита В в разгар заболевания имеет значительный диапазон колебаний, вместе с тем имеется определенная закономерность: в остром периоде существует обратная связь между концентрацией HBsAg в сыворотке и тяжестью болезни.

Высокая концентрация HBsAg чаще наблюдается при легких и среднетяжелых формах болезни. При тяжелых и злокачественных формах концентрация HBsAg в крови чаще низкая, причем у 20% больных с тяжелой формой и у 30% со злокачественной антиген в крови может вообще не обнаруживаться. Появление на этом фоне у больных антител к HBsAg расценивается как неблагоприятный диагностический признак; он определяется при злокачественных формах гепатита В.

При остром течении гепатита В концентрация HBsAg в крови постепенно снижается вплоть до полного исчезновения этого антигена. HBsAg исчезает у большинства больных в течение 3 месяцев от начала острой инфекции.

Снижение концентрации HBsAg более чем на 50% к концу 3-й недели острого периода, как правило, свидетельствует о близком завершении инфекционного процесса. Обычно у больных с высокой концентрацией HBsAg в разгар болезни он обнаруживается в крови в течение нескольких месяцев.
У больных с низкой концентрацией HBsAg исчезает значительно раньше (иногда через несколько дней после начала заболевания). В целом срок обнаружения HBsAg колеблется от нескольких дней до 4-5 мес. Максимальный срок обнаружения HBsAg при гладком течении острого гепатита В не превышает 6 месяцев от начала заболевания.

HBsAg может быть обнаружен у практически здоровых людей, как правило, при профилактических или случайных исследованиях. В таких случаях исследуют другие маркеры вирусного гепатита В – анти HBсAg JgM, анти- HBсAg JgG, анти HBеAg и изучают функцию печени.

При отрицательных результатах необходимы повторные исследования на HBsAg.
Если повторные исследования крови в течение более 3 месяцев выявляют HBsAg, такого пациента относят к хроническим больным вирусным гепатитом В.
Наличие HBsAg – довольно распространенное явление. В мире насчитывается более 300 млн. носителей, а у нас в стране – около 10 млн. носителей.
Прекращение циркуляции HBsAg с последующей сероконверсией (образование анти-HBs) всегда свидетельствует о выздоровлении — санации организма.

Исследование крови на наличие HBsAg применяется в следующих целях:

для диагностики острого гепатита В:

• инкубационный период;
• острый период заболевания;
• ранняя стадия реконвалесценции;

для диагностики хронического вирусного гепатита В;

при заболеваниях:

• персистирующем хроническом гепатите;
• циррозе печени;

для скрининга и выявления больных в группах риска:

• больные с частыми гемотрансфузиями;
• больные с хронической почечной недостаточностью;
• больные с множественным гемодиализом;
• больные с иммунодефицитными состояниями, в том числе СПИДом.

Оценка результатов исследования

Результаты исследования выражаются качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие HBsAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление HBsAg свидетельствует об инкубационном или остром периоде острого вирусного гепатита В, а также при хроническом вирусном гепатите В.

Антитела к ядерному антигену вируса гепатита В JgG (анти-HBcAg JgG)

В норме анти-HBcAg JgG в сыворотке отсутствует.
У больных анти-HBcAg JgG появляются в острый период вирусного гепатита В и сохраняются на протяжении всей жизни. Анти-HBcAg JgG – ведущий маркер перенесенного ВГВ.

Исследование крови на наличие анти-HBcAg JgG применяются для диагностики:

• хронического вирусного гепатита В при наличии HBs антигена в сыворотке крови;
• перенесенного вирусного гепатита В.

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие анти-HBcAg JgG в сыворотке крови. Положительный результат – выявление анти-HBcAg JgG свидетельствует об острой инфекции, реконвалесценции или ранее перенесенном вирусном гепатите В.

Антиген «е» вируса гепатита В (HBeAg)

В норме HBeAg в сыворотке крови отсутствует.
HBeAg можно обнаружить в сыворотке крови большинства больных острым вирусным гепатитом В. Он обычно исчезает в крови раньше HBs-антигена. Высокий уровень HBeAg в первые недели заболевания или обнаружение его на протяжении более 8 недель дает основание заподозрить хроническую инфекцию.

Этот антиген часто обнаруживается при хроническом активном гепатите вирусной этиологии. Особый интерес к определению HBeAg связан с тем, что его обнаружение характеризует активную репликативную фазу инфекционного процесса. Установлено, что высокие концентрации HBeAg соответствуют высокой ДНК-полимеразной активности и характеризуют активную репликацию вируса.

Наличие HBeAg в крови свидетельствует о высокой ее инфекциозности, т.е. присутствии в организме обследуемого активной инфекции гепатита В, и обнаруживается только в случае присутствия в крови HBs-антигена. У больных хроническим активным гепатитом противовирусные препараты применяются только при обнаружении в крови HBeAg. HBeAg – антиген – маркер острой фазы и репликации вируса гепатита В.

Исследование крови на наличие HBe-антигена применяется для диагностики:

• инкубационного периода вирусного гепатита В;
• продромального периода вирусного гепатита В;
• острого периода вирусного гепатита В;
• хронического персистирующего вирусного гепатита В.

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие HBeAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление HBeAg свидетельствует об инкубационном или остром периоде острого вирусного гепатита В или продолжающейся репликации вируса и инфекциозности больного.

Антитела к антигену «е» вируса гепатита В (anti-HBeAg)

Анти-HBeAg в сыворотке в норме отсутствует. Появление анти-НВeAg антител указывает обычно на интенсивное выведение из организма вируса гепатита В и незначительное инфицирование больного.

Эти антитела появляются в острый период и сохраняются до 5 лет после перенесенной инфекции. При хроническом персистирующем гепатите анти-НВeAg обнаруживаются в крови больного вместе с НВsAg. Сероконверсия, т.е. переход HBeAg в анти-НВeAg, при хроническом активном гепатите, чаще прогностически благоприятна, но такая же сероконверсия при выраженной цирротической трансформации печени прогноза не улучшает.

Исследование крови на наличие анти-НВeAg применяются в следующих случаях при диагностике вирусного гепатита В:

• установление начальной стадии заболевания;
• острый период инфекции;
• ранняя стадия реконвалесценции;
• реконвалесценция;
• поздняя стадия реконвалесценции.
• диагностика недавно перенесенного вирусного гепатита В;
• диагностика хронического персистирующего вирусного гепатита В.

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к HBeAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление антител к HBeAg, которые могут свидетельствовать о начальной стадии острого вирусного гепатита В, остром периоде инфекции, ранней стадии реконвалесценции, реконвалесценции, перенесенном недавно вирусном гепатите В или персистирующем вирусном гепатите В.

Критериями наличия хронического гепатита В являются:

• бнаружение или периодическое выявления ДНК ВГВ в крови;
• постоянное или периодическое повышение активности АЛТ/АСТ в крови;
• морфологические признаки хронического гепатита при гистологическом исследовании биоптата печени.

Обнаружение вируса гепатита В методом ПЦР (качественно)

Вирус гепатита В в крови в норме отсутствует.
Качественное определение вируса гепатита В методом ПЦР в крови позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает этиологию заболевания.

Данное исследование дает полезную информацию для диагностики острого вирусного гепатита В в инкубационном и раннем периоде развития заболевания, когда основные серологические маркеры в крови у пациента могут отсутствовать. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Аналитическая чувствительность метода ПЦР составляет не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл, прошедшей выявление ДНК пробы, специфичность – 98%.

Этот метод имеет важное значение для диагностики и мониторинга течения хронического ВГВ. Примерно 5-10% случаев цирроза и других хронических заболеваний печени обусловлены хроническим носительством вируса гепатита В. Маркерами активности таких заболеваний является наличие HBeAg и ДНК вируса гепатита В в крови.

Метод ПЦР позволяет определять в крови ДНК вируса гепатита В как качественно, так и количественно. Определяемым фрагментом в обоих случаях служит уникальная последовательность ДНК гена структурного белка вируса гепатита В.

Обнаружение ДНК вируса гепатита В в биоматериале с помощью ПЦР необходимо для:

• разрешения сомнительных результатов серологических исследований;
• выявление острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом;
• контроля эффективности противовирусного лечения.

Исчезновение ДНК вируса гепатита В из крови – признак эффективности терапии

Обнаружение вируса гепатита В методом ПЦР (количественно)

Этот метод дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, об эффективности лечения и о развитии резистентности к активным препаратам.
Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови применяются тест-системы, чувствительность которых составляет 50-100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5 Х 10^3 -10^4 копий/мл. ПЦР при вирусном гепатите В безусловно необходима для суждения о вирусной репликации.

Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК вируса гепатита В могут служить сыворотка крови, лимфоциты, гепатобиоптаты.

• Оценку уровня виремии осуществляют следующим образом:
• менее 2.10^5 копий/мл (менее 2.10^5 МЕ/мл) – низкая виремия;
• от 2.10^5 копий/мл (2.10^5 МЕ/мл) до 2.10^6 копий/мл (8.10^5 МЕ/мл) – средняя виремия;
• более 2.10^6 копий/мл – высокая виремия.

Существует зависимость между исходом острого вирусного гепатита В и концентрацией ДНК ВГВ в крови больного. При низком уровне виремии процесс хронизации инфекции близок к нулю, при средней – хронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии острый вирусный гепатит В чаще всего переходит в хронический.

Показаниями для лечения хронического ВГВ интерфероном-альфа следует считать наличие маркеров активной репликации вируса (выявление HBsAg, HBeAg и ДНК ВГВ в сыворотке крови в течение предшествующих 6 месяцев.).

Критериями оценки эффективности лечения служат исчезновение HBeAg и ДНК ВГВ в крови, что обычно сопровождается нормализацией уровня трансаминаз и долговременной ремиссией заболевания, ДНК ВГВ исчезает из крови к 5-му месяцу лечения у 60%, к 9-му месяцу – у 80% больных. Снижение уровня виремии на 85% и более к третьему дню от начала лечения по сравнению с исходным служит быстрым и достаточно точным критерием для прогнозирования эффективности терапии.