Лабораторная диагностика кишечных инфекций животных

РЕКОМЕНДОВАНЫ 25 июля
1978 г., б/н

1.
Общие положения

1.1. Настоящие
Методические указания распространяются на следующие вирусные
респираторно-кишечные инфекции (пневмоэнтериты) крупного рогатого
скота: инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3), вирусную
диарею (ВД), аденовирусную инфекцию (адено),
респираторно-синцитиальную инфекцию (PC), грипп.

1.2. Лабораторная
диагностика вирусных респираторно-кишечных инфекций заключается
в:

—
обнаружении антигена в патологическом материале методами
иммунофлуоресценции (ИФ), реакции связывания комплемента (РСК),
реакции диффузионной преципитации (РДП);

—
выделении возбудителя из патологического материала в культуре
клеток или на куриных эмбрионах и его идентификации в одной из
серологических реакций: РСК, РДП, реакции торможения
гемагглютинации (РТГА), реакции торможения гемадсорбции, (РТГАд),
реакции нейтрализации (РН), реакции торможения непрямой
гемагглютинации (РТНГА), ИФ;

—
выявлении антител в крови больных и переболевших животных
(ретроспективная диагностика) в одной из серологических реакций:
реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), РДП, РН, РТГА, РСК,
реакции нейтрализации вирусных гемагглютининов (РНВГ).

1.3. Схема исследований
при лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных
инфекций крупного рогатого скота (см. стр.209, 210).

1.4. При лабораторной
диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного
рогатого скота используют соответствующие каждой инфекции
диагностические наборы, выпускаемые биологической
промышленностью.

1.5. Диагностика вирусных
пневмоэнтеритов проводится параллельно с исследованием материала на
бактериальные и хламидийную инфекции.

1.6. Лабораторный диагноз
на вирусные респираторно-кишечные инфекции ставится на основании
положительных результатов обнаружения антигена в патологическом
материале с помощью одной из серологических реакций (ИФ, РДП, РСК)
или выделения и идентификации возбудителя в одной из реакций,
указанных в схеме п.1.3, или установления четырехкратного прироста
антител в крови переболевших животных.

Обозначения: ПЭК —
почка эмбриона коров; ПТ — почка телят; ТБ — тестикулы бычков; СЭК
— селезенка эмбриона коров; ЛЭК — легкие эмбриона коров.

Диагноз на вирусные
пневмоэнтериты считают установленным по результатам лабораторного
исследования с учетом эпизоотологических и клинических данных и
патологоанатомических изменений.

1.7. Для постановки
лабораторного диагноза путем обнаружения антигена в патологическом
материале требуется 2…3 дня, с помощью выделения вируса и его
идентификации — до 30 дней, а путем выявления прироста антител в
крови животных — от 2 до 4 недель.

2.
Взятие и подготовка материала для исследования

2.1. В лабораторию для
исследования направляют патологический материал от больных
животных, взятый в период максимального проявления у них
клинических признаков (температурная реакция, угнетение,
воспалительные процессы в верхних дыхательных путях,
сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой
полости, поносы, иногда аборты), или от вынужденно убитых или
павших животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их
гибели.

2.2. От больных животных
берут: 1) тампонами мазки со слизистой носовой полости (при ИРТ —
со слизистой глаз, влагалища, препуция) для реакции
иммунофлуоресценции и для выделения возбудителя; 2) фекалии — для
выделения возбудителя и 3) пробы крови — для выявления в ней титра
антител.

Тампоны с материалом
помещают в пенициллиновые флаконы с 2…5 мл питательной среды для
культуры клеток или раствора Хенкса, содержащие 1000 ЕД/мл
пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина.

Кровь в объеме не менее
5,0 мл берут в пробирки, после свертывания доставляют в
лабораторию.

2.3. От павших и
вынужденно убитых животных берут кусочки носовой перегородки,
трахеи, легких, селезенки, почки, средостенные и брыжеечные
лимфатические узлы и при поносах — кусочки тонкого отдела
кишечника. От абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных
органов, околоплодную жидкость.

2.4. Флаконы с
патологическим материалом доставляют в лабораторию в термосе со
льдом.

2.5. В лаборатории
флаконы с тампонами встряхивают 2…3 мин, тампоны отжимают и
удаляют, а содержимое флакона центрифугируют при 2 тыс. об/мин в
течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную
пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл
стрептомицина, выдерживают при 4°С в течение 2…4 ч и используют
для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов. Из осадка
центрифугата готовят мазки для исследования методом
иммунофлуоресценции.

2.6. Флаконы с фекалиями
замораживают при температуре -20°С (в морозилке холодильника) в
течение 18 ч, после чего оттаивают при 37°С и центрифугируют при 5
тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в
стерильную пробирку, вносят 1000 ЕД/мл пенициллина, 1000 мкг/мл
стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина, выдерживают при 4°С в течение
2…4 ч, дополнительно центрифугируют и используют для заражения
культуры клеток или куриных эмбрионов.

2.7. Со слизистой носовой
перегородки, трахеи, влагалища, бронхов и кишечника делают
скальпелем соскобы, вносят их в центрифужную пробирку с 5 мл
физиологического раствора и центрифугируют при 2 тыс. об/мин в
течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в 0,5 мл того же
раствора и готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах для
исследования методом иммунофлуоресценции.

Из кусочков легкого и
лимфатических узлов готовят отпечатки на предметных стеклах или
срезы толщиной 5 микрон для исследования тем же методом.

2.8. Из кусочков органов
готовят 10…20%-ную суспензию для выделения возбудителя и
приготовления комплементсвязывающего и преципитирующего
антигенов.

2.9. Для получения
суспензии (с целью выделения вируса) ткань измельчают, растирают в
ступке со стеклянным песком, разводят раствором Хенкса, содержащим
антибиотики, центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин.
Надосадочную жидкость отсасывают, выдерживают при температуре 4°С в
течение 2…4 ч и используют для заражения культуры клеток или
куриных эмбрионов.

2.10. Для изготовления
испытуемого комплементсвязывающего антигена ткань измельчают в
ступке или специальном микроизмельчителе, разводят 1:5 содержащим
антибиотики физиологическим раствором, рН 7,2…7,4. Полученную
20%-ную суспензию замораживают при температуре -20°С в течение
16…18 ч, быстро оттаивают при температуре 37°С, повторно
растирают или гомогенизируют, а затем центрифугируют при 5 тыс.
об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и далее
используют, как указано в п.5.1.

3.
Обнаружение вирусных антигенов в патологическом материале методом
иммунофлуоресценции

3.1. Метод
иммунофлуоресценции для обнаружения вируса применяется при
диагностике всех респираторно-кишечных инфекций, указанных в
п.1.1.

3.2. Полученные мазки,
отпечатки и срезы подсушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в
течение 5 мин и окрашивают флуоресцирующими сыворотками, имеющимися
в наборах диагностикумов. Каждой сывороткой окрашивают по 4
препарата из каждого органа.

3.3. Окрашивание
препаратов ведут во влажной камере при температуре 37°С в течение
45 мин. Затем препараты споласкивают в трех сменах физиологического
раствора, рН 7,2…7,4, и в дистиллированной воде, подсушивают на
воздухе. На препараты наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют
их под люминесцентным микроскопом.

3.4. Для контроля
специфичности свечения ставят реакцию подавления
иммунофлуоресценции. Для этого на два препарата из органа, при
исследовании которого получена положительная реакция
иммунофлуоресценции, наносят соответствующую выявленному вирусу
сыворотку в разведении 1:10 и выдерживают их в термостате во
влажной камере в течение 30 мин.

Препараты споласкивают в
трех сменах физиологического раствора, рН 7,2…7,4, и окрашивают
флуоресцирующей сывороткой.

3.5. Учет реакции.
Положительным результатом исследования методом ИФ считается наличие
специфической флуоресценции, которая характеризуется тем, что в
препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой, ткань
флуоресцирует тусклым зеленовато-серым цветом, а вирусный антиген
при этом выявляется в виде ярких зеленовато-желтых различных по
величине гранул или в виде диффузного свечения в цитоплазме или
(при ИРТ, адено) в ядре.

В
контрольных препаратах, обработанных последовательно специфической
и флуоресцирующей сыворотками, специфическая флуоресценция должна
отсутствовать.

Диагноз на вирусную
респираторно-кишечную инфекцию ставят при обнаружении специфической
флуоресценции не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом
из них 3…5 и более флуоресцирующих клеток или при наличии
15…20% флуоресцирующих клеток при подсчете не менее 100 клеток в
препарате. При выявлении меньшего числа флуоресцирующих клеток
диагноз подтверждают исследованием антител в парных пробах
сывороток крови больных животных или выделением возбудителя.

3.6. При исследовании
материала от животных, привитых живыми вакцинами против инфекций,
на которые проводятся диагностические исследования, положительные
результаты ИФ во всех случаях следует подтверждать исследованием
парных проб сывороток крови.

4.
Обнаружение антигена вируса ИРТ в РДП

4.1. РДП ставят в
агаровом геле.

4.2. Компоненты реакции:
специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная
сыворотка; исследуемый материал от больных животных; специфический
антиген.

4.3. Агаровую среду
готовят по прописи: агар — 1,0, физиологический раствор рН 7,4 —
100,0 мл. Агар расплавляют на водяной бане и разливают в чашки
Петри по 25 мл или на обезжиренные предметные стекла. В слое
застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки — одну
центральную и 6 вокруг нее на расстоянии 0,5…0,7 см.

4.4. Постановка реакции.
В центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в лунки по
окружности — испытуемый материал. Параллельно испытуемый материал
исследуют с отрицательной сывороткой.

Контроли:

1) контрольный
положительный антиген + специфическая сыворотка;

2) контрольный
положительный антиген + отрицательная сыворотка.

Чашки Петри или
предметные стекла помещают во влажную камеру, выдерживают при
температуре 37°С в течение 18…24 ч и затем при комнатной
температуре в течение такого же времени.

4.5. Учет реакции.
Реакцию считают положительной при условии образования ясно
выраженной линии преципитации между лунками с исследуемым антигеном
и специфической сывороткой, а также между контрольным положительным
антигеном и специфической сывороткой при отрицательном результате с
отрицательной сывороткой.

5.
Обнаружение антигена адено в патологическом материале в РСК

5.1.
Комплементсвязывающий антиген готовят из 20%-ной суспензии
патологического материала, обработанной, как указано в п.2.10. Для
этого к ней добавляют 1%-ный раствор гексаметафосфата натрия до
конечной концентрации 0,05% и раствор 1 н. НСl для снижения рН до
4,1.

Смесь оставляют на 30
мин, а затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин.
Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в 1/20
первоначального объема суспензии 0,1 М (моль/л) фосфатно-буферного
раствора, рН 7,9, содержащего 0,85% хлористого натрия. Полученный
раствор осветляют центрифугированием при том же режиме и исследуют
в РСК с иммунными сыворотками к аденовирусу крупного рогатого
скота.

5.2. Компоненты реакции:
испытуемый антиген; два стандартных специфических антигена,
относящиеся к двум антигенным подгруппам; отрицательный антиген;
две специфических сыворотки, соответствующие антигенным подгруппам;
нормальная сыворотка.

5.3. Испытуемый антиген
исследуют в двукратных разведениях, остальные антигены и сыворотки
— в удвоенном титре.

5.4. Постановка реакции.
Реакцию ставят в пробирках в объеме 0,5 мл или используют
микротитратор Такачи. РСК проводят в три этапа: титрование
комплемента в чистом виде, титрование комплемента в присутствии
антигенов и сывороток, главный опыт.

5.5. Для титрования
комплемента во вспомогательном ряду пробирок готовят различные дозы
по следующей схеме:

Комплемент титруют по следующей схеме:

Сальмонеллез

В условиях спорадической заболеваемости диагноз сальмонеллеза правомочен только при наличии комплекса характерных клинико-эпидемиологических данных и лабораторного подтверждения.

Из лабораторных методов наиболее важное значение имеют бактериологический и серологический.

Бактериологическому исследованию могут подвергаться испражнения больных, рвотные массы, промывные воды желудка, моча, кровь, желчь, гной из воспалительных очагов, подозреваемые продукты. Из серологических методов применяют реакцию агглютинации (РА) и непрямой агглютинации (РНГА).

При однократном обследовании диагностическими титрами являются 1:80 и выше у детей до 6 месяцев; 1:160 и выше у детей 6-12 мес.; 1:320 у детей старшего возраста. Для цистеинустойчивых антител 1:20 у детей до года и 1:40 у детей старше года. В последние годы используются такие высокочувствительные серологические методы определения специфических антигенов сальмонелл в крови, как О-АГА — О-агрегатгемагглютинации-экспресс метод, позволяющий выявлять свободный специфический антиген в крови.

Как диагностические учитываются титры 1:40 и выше.

В других биосубстратах больных используется метод латексной агглютинации и коагглютинации — экспресс-метод, позволяющий выявить специфический антиген в испражнениях в разные сроки болезни.

Дизентерия

Наиболее достоверным и распространенным методом лабораторного подтверждения диагноза дизентерии является выделение копрокультуры шигелл. При дизентерии, вызванной шигеллами Григорьева-Шиги, имеет значение выделение гемокультуры. В случаях гастроэнтеритов предположительно дизентерийной этиологии целесообразно бактериологическое исследование промывных вод желудка.

Забор материала для бактериологического исследования следует производить до начала этиотропного лечения, помня при этом, что частота его положительных результатов зависит от кратности проведенных анализов и сроков обследования больных.

Диагноз может быть подтвержден также серологическими методами. Из них наиболее широко используется на практике РНГА со стандартными эритроцитарными диагностикумами.

Диагностическим считается ее положительный результат при условии нарастания титра антител при повторном исследовании с интервалами в 7-10 дней.

В последние годы используются высокочувствительные серологические методы определения антител и антигенов, как РЭМА (реакция энзиммеченых антител), РКА (реакция коагглютинации). Возможно применение с целью нахождения и определения концентрации антигенов в крови и моче больных таких известных методов, как О-АГА (реакция О-агрегатгемагглютинации) и РСК (реакция связывания комплемента).

Одним из вспомогательных методов исследования является ректороманоскопия. В настоящее время применяется редко, в основном при атипичных формах заболевания.

Лабораторная диагностика кишечных инфекций

Таблица 8 Лабораторная диагностика кишечных инфекций

Эшерихиозы

Бактериологический метод — обязательный и единственный метод лабораторного подтверждения диагноза эшерихиозов. Критерии участия выделенных эшерихий в возникновении данной кишечной инфекции:

1. a) выделение эшерихий определенных сероваров, относящихся к группам ЭПКП, ЭТКП;
2. b) выделение эшерихий, относящихся к группе ЭТКП — только при условии массивности их роста (106 и выше в 1 г испражнений);
3. c) наличие термолабильного энтеротоксина активностью 3+ или 4+.

Окончательный диагноз эшерихиозов может быть поставлен только на основании бактериологического подтверждения при соблюдении вышеуказанных критериев.

Ротавирусная инфекция

1. Электронная микроскопия— обнаружение ротавирусов в фекалиях на 1-4 день болезни от начала заболевания. В связи с её сложностью и высокой стоимостью мало применима в практике.
2. Серологические методы диагностики (являются основными):
3. a) выявление вирусного антигена в фекалиях с помощью простых экспресс-методов: иммуноферментного анализа (ИФА) и твердофазной реакции коагглютинации (КОА). Этими методами удается выявить 103- 106 частиц ротавирусов в кале и в более поздние сроки болезни;
4. b) выявление специфических антител к ротавирусу в реакции нейтрализации и реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с ротавирусным антигеном.

Диагностическим является рост титров только в 4 и более раза в динамике болезни;

с) окончательный диагноз ротавирусной инфекции ставится только на основании лабораторного ее подтверждения (серологического или вирусологического).

Диагностика ОКИ, вызванных УПБ у детей раннего возраста основывается на обнаружении УПБ в фекалиях и рвотных массах в ранние сроки заболевания (до 2 -5 дня от начала кишечной дисфункции) и массивность их выделения (не менее 106 в одном грамме фекалий) и исчезновение их при выздоровлении.

Серологическая диагностика предусматривает определение антител в сыворотке крови больного к антигенам соответствующих возбудителей. В качестве антигенов используют гретые культуры аутоштаммов.

Под аутоштаммами понимают все штаммы УПБ, обнаруженные в посеве в концентрации 10е и выше.

Титры агглютининов не ниже 1:40 к аутоштаммам, их положительная динамика при обследовании на первой неделе заболевания и через 7-10 дней, может использоваться в качестве вспомогательного критерия диагностики.

Continue Reading