Методы серологической диагностики вирусных гепатитов

Для определения вируса гепатита, получения информации о происхождении болезни, условиях и причинах возникновения проводится серодиагностика гепатита с, b, a. Выявление серологических маркеров позволяет поставить диагноз и предпринять правильное лечение. К маркерам относятся вирусные белки, специфичные антитела, которые вырабатывает организм как ответ на инфекцию и нуклеиновые кислоты вируса.

Что это такое?

Серодиагностика — распознавание этиологии заболеваний способом выявления антител в крови. Серологические маркеры относятся к поздней диагностике, так как реакции возможны на 10−12 дней от начала болезни. Серодиагностические исследования проводят, чтобы:

• диагностировать заболевание — определить наличие антител в крови, используя стандартные антигены;
• определить возбудитель — выявить неизвестные антигены.

Для проведения серодиагностики используют: бактериальные клетки; плазмоциты и лимфоциты, опухолевые и пораженные клетки; растворимые компоненты. Выделяют 6 групп серологических реакций:

1. Реакции, которые происходят с укрупнением частиц Ag.
2. Реакции связывания комплемента и иммунный гемолиз.
3. Реакция иммунофлюоресценции.
4. Реакции нейтрализации Anti.
5. Реакция с фагоцитозом.
6. Реакции иммуносорбентного анализа с применением антигенов и антител.

Вернуться к оглавлению

Что показывает анализ?

Проведение серодиагностики назначают больным, если по каким-то причинам нет возможности провести диагностику, исключающую заболевание. Анализ выявляет тип возбудителя инфекции и помогает поставить диагноз. Также серодиагностика позволяет подобрать наилучший вариант лечения. Симптомы для сдачи анализа: необоснованные приступы слабости, плохой аппетит, тошнота, изменение цвета каловых масс и урины, желтизна кожи. Своевременная серодиагностика подтверждает или опровергает инфицирование и определяет стадию заболевания.

Вернуться к оглавлению

Особенности серодиагностики и вид гепатита

Иммуноферментный анализ для серодиагностики гепатита С.

Оболочка каждого вируса имеет собственный набор белков. А аминокислоты, которые составляют белок, считаются своеобразным кодовым набором. Этот код и является маркером при серодиагностике. Маркерами гепатита А являются anti-НАV IgM и IgG. Маркерами гепатит В — HBcAg, HBsAg, HBeAg. Маркерами вируса С — HBCAg. Для проведения серодиагностики на вирус А применяют: ИЭМ (иммуноэлектронную микроскопию), РСК (связывания комплемента), РИА (применение меченых Anti и Ag), РЭМА (реакцию энзим антител). Серодиагностика на вирус В использует РИА, РЭМА, РПГ (преципитация в геле) и РИГА (непрямая гемагглютинация). При реакции РИГА используют эритроциты, которые нагружены HBsAg. Для серодиагностики гепатита С применяют иммуноферментный анализ.

Вернуться к оглавлению

Маркеры гепатита A

Исследование при гепатите А нацелено на определение IgM и IgG. Данные показатели появляются в крови как только уровень сывороточных ферментов в организме увеличивается. Anti-НАV IgМ — является показателем уровня антител М к вирусу гепатита. После инфицирования показатель вырастает и пока не появятся первые симптомы, анализ крови будет показывать положительный результат. Аnti-НАV IgG — данный класс определяется через 10 недель после попадания инфекции в организм. Показатель чаще всего остается высоким и после выздоровления, он свидетельствует о том, что начинается процесс формирования иммунитета к вирусу типа А.

С помощью маркера HBsAg можно выявить гепатит B на самом раннем этапе, антиген проявляется на 27−41 день после попадания инфекции в организм.

Вернуться к оглавлению

Маркеры гепатита B

Исследование нацелено на выявление антигенов и антител. Серодиагностика позволяет поставить диагноз и спрогнозировать исход болезни. Для каждой стадии, обнаруживается разный маркер HBV. На протяжении инкубационного периода антиген сохраняется в крови от 2 до 5 месяцев. Показателем инфицирования является одновременное определение HBs и НВс. В начале восстановления из крови исчезают HBc и HBe, образуется anti-НВс, позже в крови определяются антитела ко всем типам антигена. Наличие HbsAg говорит о заражении, если антиген есть в крови больше полугода, значит, заболевание находится в хронической стадии. Anti-HbsAg — показывает, что в организме образовались антитела и иммунная система активно борется с вирусом. HbsAg выявляется еще некоторое время после выздоровления. Anti-HbcAg выявляется с проявления симптомов и продолжается на протяжении всего периода.

При лабораторных исследованиях выявляются два класса антитела: IgM — синтезируется на ранних сроках и является признаком недавнего заражения или большой активности вируса. IgG — формируются через 2−3 месяца после инфицирования, обеспечивает иммунитет. Показатель HbeAg говорит об активности инфекции. Пациенты, у которых в крови обнаружен антиген — опасны для передачи вируса, поэтому должны соблюдать осторожность. При выявлении Anti-HbeAg, начинает формироваться иммунитет.

Вернуться к оглавлению

Маркеры гепатита C

Вирус гепатита С размножается неактивно, поэтому возникают трудности в диагностике инфицирования. Единственный способ выявления вируса С — определение РНК. Его определение проводят способом иммуноферментного анализа, выявляя количество Anti-HCV. Антитела определяются через 4−6 недель после попадания вируса в кровь. В этот период начинается формирование и циркуляция IgM. Через 3 месяца начинается синтез IgG. Длительное обнаружение IgM говорит об активности вируса и хронической стадии болезни. При хронической форме выявление IgM свидетельствует о поражении печени. Результат иммуноферментного анализа не является основанием для постановки диагноза, метод используется как скрининговый тест для выявления хронической формы. Обнаружив антитела к HCV и при подозрении на гепатит С необходимо пройти комплексное лабораторное обследование.

Иммуноферментный анализ серодиагностики позволяет обнаружить антитела к гепатиту С в 95% случаев хронической формы, при острой форме — точность метода 50−70%.

Серодиагностика не имеет 100% специфичности и чувствительности при диагностике вирусных гепатитов. Поэтому при оценке результатов необходимо учитывать симптоматику и использовать для диагностики несколько тестов, подтверждающих полученный результат. При оценке результатов серологических исследований следует учитывать анамнез заболевания, сведения о перенесенных заболеваниях и вакцинации, а также возможный контакт с источником инфекции.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела.

Метод обнаружения с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого .

В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, соответствующих применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых.

Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой вначале заболевания (3-7 день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и более повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (JgM и JgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.

При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентом в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М (JgM). Лишь позднее, на 8-12-й день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G (JgG). При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (JgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеинов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется.

Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, т. е. одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например вирус гепатита С.

ПЦР — это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:
• возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в том числе и в материале, получаемом при биопсии;
• возможна диагностика инфекционных болезней на самых разных стадиях заболевания;
• возможность количественной оценки результатов исследований ( сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
• высокая чувствительность метода.

Исследования вирусов гепатита

В настоящее время выделяют следующие формы вирусных гепатитов: гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, гепатит G и гепатит ТТ. Для диагностики каждой из перечисленных форм вирусных гепатитов используется определенный перечень маркеров.

Вирусный гепатит А

Гепатит А — острая энтеровирусная инфекция. Возбудитель — вирус гепатита А (ВГА,HAV) — энтеровирус типа 72. Геном вируса представлен однонитчатой РНК. Вирус гепатита А содержит единственный антиген (HA-Ag). Удельный вес гепатита А в суммарной заболеваемости вирусными гепатитами составляет 70-80%. В структуре заболеваемости гепатитом А дети составляют до 80%, причем основная масса — дошкольники и школьники начальных классов.

ИФА и ПЦР исследования при гепатите А

Вирусный гепатит В

Гепатит В – вирусная антропонозная инфекция. Возбудитель вирус гепатита В (ВГВ, HBV) – относится к семейству гепаднавирусов, ДНК-содержащих вирусов, поражающих клетки печени. Вирионы ВГВ имеют наружную липопротеидную оболочку и нуклеокапсид, содержащий двунитчатую ДНК и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу.

В структуре ВГВ (HBV) выделяют следующие антигенные системы:
• поверхностный («австралийский») антиген, HBsAg, находящийся в составе липопротеидной оболочки ВГВ, является маркером ВГВ, указывая на инфицированность вирусом;
• ядерный (core), HBcAg – обнаруживается в составе нуклеокапсида вирионов, свидетельствует об активной репродукции вируса;
• HBeAg – входит в состав ядра ВГВ, указывая на активность вируса и, кроме того, на его высокую вирулентность и инфицированность;
• HBxAg – расположен вблизи оболочки вириона, его роль в генезе инфекции изучается.

В диагностике вирусного гепатита В ведущее значение имеет определение комплекса маркеров гепатита. Свыше 5% населения планеты охвачено этой инфекцией, а частота безжелтушных форм ВГВ составляет, по данным разных авторов, от 60 до 82%.

ИФА и ПЦР исследования при диагностике вируса гепатита В

Вирус гепатита С, генотипы

Гепатит С (ВГС) – вирусное заболевание, наиболее часто протекающее в виде посттрансфузионного гепатита с преобладанием безжелтушных и легких форм и склонное к хронизации процесса.

Возбудитель — вирус гепатита С – имеет сходство с флавовирусами, содержит РНК. На основе филогенетического анализа выделено 6 генотипов ВГС и более 80 субтипов.

Генотип 1 — наиболее распространенный генотип во всем мире (от 40 до 80%). Генотип 1а является доминирующим для США, а 1b преобладает в Западной Европе и Южной Азии.

Генотип 2 распространен во всем мире, однако встречается с меньшей частотой, чем генотип 1 (от 10 до 40%).

ВГС тип 3 характерен для Индии, Пакистана, Австралии и Шотландии. Генотип 4 распространен преимущественно в Средней Азии и Египте, генотип 5 – в Южной Африке, а генотип 6 – в Гонконге и Мокао.

Примерно 90% всех случаев посттрансфузионных гепатитов связано с ВГС. Среди доноров антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) обнаруживают в 0,2-5% случаев.

У 40-75% пациентов регистрируется бессимптомная форма болезни, у 50-75% больных острым ВГС формируется хронический гепатит, у 20% из них развивается цирроз печени. Важная роль ВГС отводится и в этиологии гепатоклеточной карциномы.

Геном вируса гепатита С представлен одноцепочечной положительно заряженной РНК, которая кодирует 3 структурных и 5 неструктурных белков. К каждому из этих белков вырабатываются антитела, обнаруживаемые в крови больных гепатитом С.

Отличительной чертой ВГС является волнообразное течение заболевания, в котором разграничивают 3 фазы: острую, латентную и фазу реактивации.
Для острой фазы характерно повышение активности печеночных ферментов в сыворотке крови, уровня антител класса IgM и IgG к ВГС с нарастанием титров, а также РНК ВГС.

Латентная фаза характеризуется отсутствием клинических проявлений, наличием в крови антител класса IgG к ВГС в высоких титрах, отсутствием антител класса IgM и РНК ВГС либо их присутствием в низких концентрациях на фоне незначительного повышения активности печеночных ферментов в периоды обострения.
Для фазы реактивации характерно появление клинических признаков, повышение активности печеночных ферментов, наличие антител класса IgG (к нуклеокапсидному белку core и неструктурным белкам NS) в высоких титрах, присутствие РНК ВГС и нарастание титров антител класса IgM к ВГС в динамике.

ИФА и ПЦР исследования на вирус гепатита С, определение генотипа

Вирусный гепатит D

Гепатит D – вирусная инфекция, вследствие биологических особенностей вируса протекающая исключительно в виде ко- или суперифекции при гепатите В, характеризующаяся тяжелым течением,
часто неблагоприятным исходом.

Самостоятельно, без вируса В, вирус гепатита D не может попасть в организм человека

Возбудитель – вирус гепатита D (ВГD), по своим биологическим свойствам приближается к вироидам – обнаруженным молекулам нуклеиновых кислот. Печень человека – единственное место размножения (репликации) ВГD.

Известно существование двух вариантов инфекции: коинфекция (одновременное заражение ВГВ и ВГD) и суперинфекция (заражение HBsAg-позитивных пациентов). Сочетание ВГВ и ВГD сопровождается развитием более тяжелых форм патологического процесса, что определяется главным образом действием ВГD.

Летальность при суперинфекции достигает 15-20%. Инфицирование дельта-вирусом может вызывать острое заболевание, заканчивающееся выздоровлением, или формировать хроническое носительство ВГD.

При гепатите D могут отсутствовать в крови маркеры гепатита В – анти НВс и НВs-антиген – и наблюдается угнетение ДНК-полимеразной активности, так как ВГD ингибирует репликацию вируса гепатита В.

ИФА и ПЦР исследования на вирус гепатита D