Моноклональные антитела в лечении гепатита с

Цель

Определение рабочей концентрации моноклонального антитела 6B11 к рекомбинантному белку NS4 вируса гепатита С методом иммуноферментного анализа, при которой комплекс антиген-антитело является наиболее стабильным.

Описание

Вирус гепатита С (ВГС) является одной из наиболее актуальных проблем современности. Это заболевание имеет широкую распространённость: по данным ВОЗ, хронической инфекцией гепатита С страдают около 70 миллионов человек во всём мире, и примерно 399 000 человек ежегодно умирают от этого заболевания.

В связи с этим в мае 2016 года Всемирной ассамблеей здравоохранения разработана стратегия, перспективой которой является ликвидация вирусного гепатита на 90 % и сокращение случаев смерти из-за вирусного гепатита на 65 % к 2030 году.

Актуальность изучения этого заболевания обусловлена:

— высоким риском хронизации инфекции (в 55–85 % случаев острый гепатит С принимает хроническую форму);

— неблагоприятным исходом (у 20–30 % инфицированных лиц гепатит С приводит к циррозу печени или гепатоцеллюлярной карциноме);

— малодоступностью лечения и его высокой стоимостью;

— высокой способностью к изменчивости вируса, затруднённостью симптоматической диагностики (у 80 % людей на начальной стадии заражения не проявляется никаких симптомов, а дальнейшие проявления гепатита С совпадают с проявлениями других заболеваний).

Большую роль в развитии болезни играет вирусный белок NS4, который создаёт мембранную сеть с комплексом репликации РНК-вируса. Таким образом, изучение этого белка играет ключевую роль в лечении гепатита С. Активность белка в клетке можно проследить, пометив его антителом, но для этого необходимо подобрать такое антитело и такую его концентрацию, чтобы комплекс антиген-антитело был наиболее стабильным в среде организма человека.

В работе изучалась способность белка NS4 формировать комплекс антиген-антитело с моноклональным антителом 6В11, что необходимо для изучения механизма функционирования NS4 в культуре клеток гепатокарциномы человека с помощью моноклональных антител.

Моноклональные антитела в лечении гепатита с

Задачи

1. Определить эффективность моноклонального антитела 6В11 и возможность его использования в дальнейших исследованиях вирусного белка NS4.

2. Подобрать наиболее эффективную концентрацию моноклонального антитела.

Около 10 лет назад создание вакцины против вируса гепатита С считалось невозможным, так как у вируса было огромное количество штаммов. Однако в настоящее время ведётся активная разработка вакцин против вируса гепатита С, направленных как на профилактику, так и на лечение гепатита С. На данный момент есть несколько направлений, в которых идёт создание вакцины: ДНК-вакцины; пептидные вакцины; вакцины, содержащие ослабленные возбудители; вакцины на основе цельных дрожжей; вакцины на растительной основе и вакцины на основе грибов. В работе подробнее рассказано о ДНК-вакцинах и пептидных вакцинах. ДНК-вакцина против гепатита С основана на активации периферических Т-лимфоцитов, которые способны входить в печень и уничтожать заражённые вирусом клетки. В 2007 году в Уханьском университете (Китай) было создана плазмида, с которой экспрессировалось 6 мутантных рекомбинантных белков E1, которые снижают иммунный ответ хозяина путём блокировки эпитопов Т и В-лимфоцитов. В 2010 году в Швеции была создана вакцина, которая усиливала экспрессию вирусных белков NS3 и NS4A, в ответ на которые в организме заражённого выделяется большое количество Т-лимфоцитов. ДНК-вакцины являются довольно успешными, так как обладают низкой токсичностью. Однако необходима подходящая комбинация действующего вещества и адъюванта, которая может быть определена лишь эмпирически. В настоящее время две ДНК-вакцины (ISCOMATRIX + r*Core and MF59 + r*E1/E2) прошли первый этап лабораторных испытаний. Принцип действия пептидных вакцин также основан на активации Т-клеточного иммунитета путём создания небольших пептидных эпитопов к лимфоцитам организма заражённого из аминокислотных последовательностей вируса. Преимущества таких вакцин – невысокая цена и безопасность производства, а также отсутствие токсинов. Например, в Австрии разработана вакцина «IC41», которая содержит некоторые белки мембраны и группы белков NS3 и NS4. Эта вакцина показала себя достаточно успешной, так как, по данным одного исследования, у 66 % наблюдаемых выявлено статистически значимое снижение вирусной РНК. Однако 2-я фаза клинических испытаний показала увеличение иммунного ответа лишь у 25 % вакцинируемых. Также в фазе первых клинических испытаний находится пептидная вакцина на основе виросом от компании Pevion Biotech Ltd. Оболочка виросомы состоит из фосфолипидов, в которые включены гемагглютинин и нейраминидаза вируса гриппа.

Содержимое виросомы представлено синтетическим фрагментом белков капсида вируса гепатита С.

Исследование и перспектива изучения помеченных МКА 6В11 белков NS4B вируса гепатита С может уточнить роль этого белка в вирусе, так как на данный момент известно лишь то, что он создаёт мембранную сеть, которая помогает репликации, однако более точный механизм пока не открыт.

Были выбраны два варианта разведения МКА – 8 мкг/мл (1:1000) и 10 мкг/мл.

Для работы наиболее подходящим оказался метод непрямого твёрдофазного ИФА, который основан на образовании комплекса антиген-антитело.

Ход работы

1 этап. Сорбция рекомбинантного белка.

Рекомбинантный белок rNS4 засорбировали в разведении 1:2000 по 50 мкл/лунку 96-луночного микропланшета с использованием PBS×1 (однократного соляного буфера).

Инкубация проводилась при +4 °C в течение ночи.

2 этап. Отмывка после сорбции.

Отмывка необходима для удаления несвязавшихся веществ. В каждую лунку многоканальным семплером вносили по 250 мкл PBSTw20 (соляного буфера с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %). Панель отмывали в течение 3 минут, затем содержимое лунок сбрасывали. Отмывку повторяли 4 раза.

3 этап. Титрование и внесение моноклонального антитела 6B11.

4 этап. Инкубация. Проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой для предотвращения испарения и кантаминирования.

5 этап. Отмывка. Повторная отмывка для удаления первичных антител, не связавшихся с антигенами. Процесс отмывки производился так же, как на 2 этапе.

6 этап. Внесение конъюгата. В качестве конъюгата использовали вторичные козьи антитела, соединённые с пероксидазой хрена в разведении 1:500 по 50 мкл на лунку с использованием казеина. Инкубация проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой.

7 этап. Инкубация в термостате при +37 °C.

8 этап. Отмывка не связавшихся вторичных антител производилась так же, как на 2-м и 5-м этапах.

9 этап. Внесение субстрата.

10 этап. Инкубация при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

11 этап. Остановка реакции, внесение стоп-реагента по 50 мкл на лунку.

12 этап. Определение результатов на микропланшетном анализаторе.

Для определения рабочей концентрации МКА 6B11 были построены графики с помощью программы Microsoft Excel.

Моноклональные антитела в лечении гепатита с

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Рекомбинатный белок NS4

• Мышиные моноклональные антитела

• Конъюгат (козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена)

• Субстрат

• Стоп-реагент

• Казеин для разведения

• PBS×1 (однократный соляной буфер)

• PBSTw20 (соляной буфер с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %)

• Микропланшет

• Многоканальный семплер

• Термостат

• Микропланшетный спектрофотометр (ИФА-ридер)

Результаты

1. Результаты по МКА 6В11 в разведении 8 мкг/мл являются более достоверными, поэтому для дальнейшей работы будет использована концентрация 7,51 мкг/мл моноклонального антитела.

2. В разведении 8 мкг/мл наиболее эффективная концентрация 6В11 меньше, чем в разведении 10 мкг/мл, поэтому использовать концентрацию 7,51 мкг/мл более целесообразно.

3. Доказана эффективность практического применения моноклональных антител на примере МКА 6В11, что обеспечивает возможность его дальнейшего использования в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Перспективы использования результатов работы

Исследование механизма функционирования rNS4, помеченного моноклональными антителами, в культуре клеток гепатокарциномы человека.
Возможность дальнейшего использования моноклонального антитела МКА 6В11 в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина.

Особое мнение

«Конференция мне очень понравилась, хороший обмен опытом с ребятами и экспертами в этой области. Хорошо, что проводились мастер-классы, особенно понравилось на кафедре анатомии. Есть предложение по возможности увеличить число мастер-классов по разным темам»

Источник

Ученые из компании MassBiologics при Медицинской Школе Университета Массачусетса (University of Massachusetts Medical School, UMMS, США) разработали моноклональные антитела, предотвращающие заражение клеток печени вирусом гепатита С (HCV).

Вирусом гепатита С инфицировано около 170 млн. людей по всему миру. Поражение печени вирусом гепатита С занимает первое место в списке причин, служащих показанием к проведению трансплантации печени. Так, в США ежегодно донорскую печень получают 6 тыс. пациентов, при этом приблизительно в 50% случаев у этих больных диагностируют гепатит С. Согласно данным Центров Контроля и Профилактики Заболеваний США (US Centers for Disease Control and Prevention, CDC), вирусом гепатита С инфицировано 3,2 млн. американцев, и приблизительно 10 тыс. человек ежегодно умирает из-за этого заболевания. Недавно CDC рекомендовали людям, рожденным в период с 1945-1965 гг., пройти лабораторное обследование, направленное на выявление HCV, не зависимо от вероятности быть инфицированным.

Для пациентов с терминальной стадией гепатита С трансплантация печени является единственным возможным методом лечения. Несмотря на то, что эта процедура необходима для спасения жизни пациента, она не приводит к излечению от заболевания. Практически во всех случаях трансплантированная печень оказывается инфицированной HCV, поскольку во время хирургического вмешательства вирус сохраняется в крови больного. После трансплантации печени течение гепатита С становится более активным, и приблизительно у 20% пациентов, перенесших трансплантацию, через пять лет развивается цирроз донорской печени. К сожалению, традиционные противовирусные препараты, применяемые в настоящее время для лечения пациентов с гепатитом С до наступления терминальной стадии заболевания, плохо переносятся после трансплантации печени, что ограничивает терапевтические подходы к лечению этих больных. По словам Роберта Э. Лэнфорда (Robert E. Lanford) из Техасского Биомедицинского Исследовательского Института, принимавшего участие в новом исследовании, основным препятствием на пути полного выздоровления пациента является инфицирование донорской печени сохранившимся в организме вирусом гепатита С.

Результаты нового исследования, проведенное в Юго-Западном Национальном Исследовательском Центре Приматов при Техасском Биомедицинском Исследовательском Институте (Texas Biomed’s Southwest National Primate Research Center, США), показали, что человеческие моноклональные антитела против вируса гепатита С, предотвратили развитие заболевания у шимпанзе. Эффект воздействия зависел от введенной дозы антител. Шимпанзе – единственные млекопитающие, кроме человека, которых можно инфицировать вирусом гепатита С. В связи с этим полученные результаты важны для создания моноклональных антител в будущем.

Компания MassBiologics разрабатывает моноклональные антитела HCV1 в качестве нового метода лечения пациентов с терминальной стадией поражения печени вирусом гепатита С, которым показана трансплантация печени. HCV1 – моноклональные антитела, присоединяющиеся к поверхности вируса гепатита С и блокирующее его способность проникать в клетки печени. Результаты предыдущих исследований показали, что моноклональные антитела HCV1 препятствуют инфицированию вирусом гепатита С культуры клеток печени в лабораторных условиях.

Лэнфорд объяснил, что во время экспериментов ученые имитировали условия окружающей среды после трансплантации печени и доказали, что высокая концентрация антител может защитить клетки печени от инфицирования вирусом. По его мнению, полученные результаты можно улучшить путем применения смеси антител или использования антител в сочетании с некоторыми новейшими противовирусными препаратами, проходящими сейчас клинические испытания.

В исследовании принимали участие ученые из биофармакологической компании MassBiologics, Техасского Биомедицинского Исследовательского Института, Национальных Институтов Здоровья США (National Institutes of Health, NIH) и фармацевтической компании Merck Research Laboratories. Финансирование исследования осуществлялось компанией MassBiologics и NIH. Результаты исследования были опубликованы в журнале PLoS Pathogens.

По материалам Texas Biomedical Research Institute

Оригинальная статья:
Trevor J. Morin, Teresa J. Broering, Brett A. Leav, Barbra M. Blair, Kirk J. Rowley, Elisabeth N. Boucher, Yang Wang, Peter S. Cheslock, Michael Knauber, David B. Olsen, Steve W. Ludmerer, Gyongyi Szabo, Robert W. Finberg, Robert H. Purcell, Robert E. Lanford, Donna M. Ambrosino, Deborah C. Molrine, Gregory J. Babcock. Human Monoclonal Antibody HCV1 Effectively Prevents and Treats HCV Infection in Chimpanzees. PLoS Pathogens, 2012; 8 (8): e1002895 DOI: 10.1371/journal.ppat.1002895

Источник

НОВОСТИ. Новые методы лечения

Началось испытание моноклональных антител против гепатита С

Ученые из Военно-медицинской академии Массачусетса объявили о начале первой фазы испытаний для проверки безопасности и эффективности моноклонального антитела человека, нейтрализующего вирус гепатита С.
Первому добровольцу вещество MBL-HCV1 было введено 28 июля 2009 года. Сейчас исследование продолжается, и будет собрана группа из 30 здоровых участников. Исследование поможет ученым определить полезную дозу и другие параметры, необходимые для второй фазы испытаний на пациентах с пересаженной печенью.

Трансплантация спасает пациентов, но почти всегда новый орган поражается вирусом гепатита С, потому что он остается в крови. Антивирусные препараты не могут быть использованы после пересадки, поскольку есть риск отторжения печени. Повторное заражение почти в 40% случаев приводит к отказу органа.

Новое антитело будет частью лечения, применяемого сразу после пересадки. Оно нейтрализует вирус в крови пациента, не давая ему заразить печень. Известно, что моноклональные антитела не обладают побочными эффектами, потому их можно спокойно применять после операции. Physorg News

08.08.2009 Моноклональные антитела в лечении гепатита с 890 Показ