Смешанная кишечная инфекция методические указания
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Минсельхозпрод России) ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ 107139, Москва, Орликов пер., 1/11 Для телеграмм: Москва, 84 Мннроссельхозпрод Телекс: 417738 ЛЕН Телефон: 975-58-50 11.10.99 г. № 13-7-2/1759 | УТВЕРЖДАЮ Зам. руководителя Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ ____________ В.В. Селиверстов 11 октября 1999 г. |
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по бактериологической диагностике
смешанной кишечной инфекции
молодняка животных, вызываемой
патогенными энтеробактериями
1. Общие положения
1.1. Смешанная кишечная инфекция — остропротекающая инфекционная болезнь молодняка разных видов сельскохозяйственных животных, которая имеет полиэтиологическую природу и вызывается двумя-тремя и более видами патогенных энтеробактерий, относящимся к родам Escherichia, Citrobacter, Proteus, Morganella, Klebsiella, Salmonella. Помимо указанных микроорганизмов возбудителями болезни могут быть также бактерии других родов и семейств — Yersinia, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium и пр. Наряду с бактериальными агентами нередко (особенно на крупных фермах) болезнь обусловливают корона- и ротавирусы.
1.2. Болезнь возникает в первые дни и недели жизни животных и проявляется чаще в виде энзоотической вспышки, развитию которой способствуют различные факторы, связанные с несоблюдением технологических и ветеринарно-санитарных требований воспроизводства стада, а также нарушением режимов содержания и кормления молодняка.
1.3. Смешанная кишечная инфекция может протекать в кишечной (энтеритной) и септической формах. При кишечной форме возбудители болезни локализуются только в желудочно-кишечном тракте и брыжеечных лимфоузлах, регионарных поражённым участкам кишечника; при септической форме — в паренхиматозных органах, различных тканях, а также в кишечнике и брыжеечных лимфоузлах. Основными клиническими признаками болезни являются: потеря аппетита, понос, переходящий в профузный, нарастающая слабость, депрессия, учащенное дыхание и сердцебиение, обезвоживание организма (при затяжном течении); нередко наблюдается поражение центральной нервной системы (возбуждение, судороги), иногда пневмония, артриты; температура тела в пределах нормы, в отдельных случаях повышена на 0,5 — 1 °С, в предагональном состоянии она снижается ниже нормы.
1.4. Патологоанатомические изменения у погибших животных имеют картину катарального или катарально-геморрагического гастроэнтерита, на слизистой желудка, тонкого отдела кишечника и слепой кишки могут встречаться язвы, нередко отмечаются множественные точечные, полосчатые и пятнистые кровоизлияния на слизистой желудка, толстого и тонкого отделов кишечника, под капсулой селезенки, эпи- и эндокарде (клапанах); иногда отмечается очаговая катаральная пневмония и отек легких, дистрофия печени; регионарные брыжеечные лимфатические узлы как правило увеличены, отечны, на разрезе розового или красно-вишневого цвета; при вскрытии черепной коробки — гиперемия кровеносных сосудов и отек ткани головного мозга. Указанные изменения могут быть в отдельных или одновременно в нескольких органах.
1.5. Диагноз на смешанную кишечную инфекцию в хозяйствах устанавливают на основании совокупности эпизоотологических данных (возраст заболевших животных, массовость поражения, стационарность и др.), клинических признаков болезни, патологоанатомической картины и результатов бактериологического (при необходимости еще и вирусологического) исследования патологического материала от больных или погибших животных.
2. Отбор материала для исследования
2.1. Для посмертной бактериологической диагностики в лабораторию направляют 2 — 4 свежих трупа погибших или убитых с диагностической целью больных животных (желательно не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами). В случае невозможности доставки целого трупа посылают следующий патологический материал: голову, трубчатую кость, сердце, перевязанное лигатурой вблизи разреза сосудов и аорты, селезенку, долю печени с желчным пузырем, брыжеечные лимфатические узлы, регионарные воспаленному участку кишечника, а также пораженный отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух концов лигатурой (в отдельной таре или полиэтиленовом пакете). Указанный патологический материал исследуют в день поступления его в лабораторию.
2.2. Для прижизненной бактериологической диагностики в лабораторию направляют фекалии больных диареей животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Пробы фекалий берут от 5 — 6 больных животных одной фермы в стерильные пробирки по 2 — 3 г непосредственно из прямой кишки с помощью прокипяченного резинового катетера. Пробирки вместе с сопроводительной запиской упаковывают в полиэтиленовый пакет или картонную коробку.
При невозможности быстрой доставки проб фекалий в лабораторию (через 3 — 4 часа после взятия) их консервируют стерильным 30 %-ным глицериновым раствором в соотношении 1:2 (см. приложение).
2.3. Пробы фекалий и содержимого тонкого отдела кишечника (в количестве не более 0,5 г) разводят в 10 см3 стерильного 0,85 %-ного раствора хлорида натрия, тщательно размешивают и затем выдерживают 10 — 15 минут при комнатной температуре для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость используют для посева на питательные среды не позднее 1 — 2 часов после приготовления взвесей. При исследовании консервированных фекалий, их тщательно размешивают, после чего разводят физиологическим раствором в 5 — 10 раз.
3. Выделение культур энтеробактерий, изучение их морфологических, культуральных и ферментативных свойств
3.1. Патологический материал (за исключением содержимого тонкого отдела кишечника и фекалий) засевают в пробирки с МПБ и на плотные дифференциально-диагностические среды в чашках: Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-сульфит агар). Содержимое тонкого отдела кишечника и фекалий засевают только на указанные выше плотные среды в чашках. Кроме того для выделения из фекалий сальмонелл неразведенные пробы фекалий засевают еще в одну из сред обогащения (селенитовый бульон, магниевую, Мюллера или др.) в соотношении 1:5.
3.1.1. Посев материала в МПБ проводят пастеровской пипеткой. Посевы на плотные среды в чашках из внутренних органов и тканей, указанных в п. 2.3, делают путем отпечатков разрезанной поверхностью кусочка органа из предварительно профламбированного участка на подсушенную питательную среду или вносят материал пастеровской пипеткой на поверхность среды, а затем равномерно растирают его стеклянным шпателем.
3.1.2. Содержимое тонкого отдела кишечника, взятое путем соскоба с пораженного участка слизистой оболочки, суспендируют в 10 см3 стерильного 0,85 %-ного раствора хлорида натрия, затем засевают суспензию бактериологической петлей на подсушенные в термостате плотные дифференциально-диагностические среды в чашках широким частым штрихом по всей поверхности среды. Аналогичным образом проводят посев разведенных фекалий.
3.2. Пробирки с посевами в МПБ из внутренних органов и тканей инкубируют при температуре 37 — 38 °С в течение 18 — 24 часов. При наличии в МПБ помутнения среды культуру микроскопируют и в случае обнаружения мелких грамотрицательных палочек пересевают ее на агар Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-сульфит агар) в чашках, которые помещают в термостат (37 — 38 °С ) на 18 — 24 часа.
Пересев культур, полученных в МПБ, на плотные селективные среды проводят в том случае, если отсутствует рост колоний на этих средах в первичных посевах из соответствующих органов и тканей.
3.3. Чашки с посевами на агаре Эндо (или Левина) из внутренних органов, тканей или фекалий инкубируют при температуре 37 — 38 ° С в течение 18 — 24 часов. После просмотра культур пересевают колонии лактозоположительных бактерий (круглые, средних размеров S-формы, красно-малинового цвета на агаре Эндо и темно-фиолетового цвета на агаре Левина с наличием или отсутствием металлического блеска) в чашки с МПА и средой Минка в соответствии с рекомендациями, изложенными в действующих «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных».
При наличии на агаре Эндо (или Левина) роящегося налета, характерного для протея, пересевают его на скошенный МПА (культуры из двух-трех внутренних органов, тканей или фекалий). Чашки и пробирки с посевами инкубируют 18 — 20 часов при той же температуре.
3.4. Чашки с первичными посевами на агаре Плоскирева инкубируют при температуре 37 — 38 °С в течение 24 — 36 часов. После просмотра культур пересевают мелкие круглые колонии S-формы полупрозрачные, сероватого цвета с голубым оттенком в пробирки со скошенным МПА (по 1 — 2 колонии с культур из двух-трех внутренних органов, тканей или фекалий, каждую колонию в отдельную пробирку), которые помещают в термостат на 18 — 24 часа.
В том случае, если пересев проводят на комбинированную среду (Олькеницкого, Клиглера), то каждую колонию пересевают в одну пробирку с этой средой и в одну пробирку со скошенным МПА.
3.5. Суточные культуры бактерий на скошенном МПА или комбинированной среде, выделенные из внутренних органов, тканей или фекалий, микроскопируют (окраска по Граму) и при наличии в мазках однородных мелких грамотрицательных палочек, не образующих спор и капсул (бактерии вида Klebsiella pneumoniae образуют капсулу), используют для изучения ферментативных, патогенных, антигенных свойств, а также (при необходимости) определения подвижности в полужидком МПА. Для выявления у культур клебсиелл капсулы окраску мазков проводят по методу Гинса (тушью).
3.6. Ферментативные свойства изучают у 2 — 6 агаровых (в порядке исключения у бульонных) культур бактерий, выделенных из одного патологического материала, на наборе сред с углеводами и индикатором Андреде или полужидких средах с индикатором ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на средах с мочевиной, сернокислым железом (определение сероводорода), агаре Симонса, в бульоне Хоттингера или МПБ (определение индола), мясопептонной желатине, среде с фенилаланином.
При использовании комбинированной среды Олькеницкого или Клиглера учитывают изменения, вызываемые представителями разных родов энтеробактерий в этой среде, после чего данную культуру изучают по другим необходимым биохимическим тестам.
Засеянные пробирки инкубируют при температуре 37 — 38 °С.
Предварительные результаты изучения ферментативных свойств культур учитывают через 24 часа, окончательные результаты — через 48 часов. Изучение ферментативных свойств культур энтеробактерий можно проводить также с помощью тест-системы для биохимической идентификации энтеробактерий. Родовую и видовую принадлежность культур устанавливают по показателям таблицы.
Следует учитывать, что у бактерий рода Proteus встречаются нероящиеся штаммы, образующие при росте на плотных питательных средах мелкие круглые колонии S-формы сероватого цвета. Важными признаками родовой идентификации таких штаммов является их способность дезаминировать фенилаланин и разжижать желатин.
При наличии у культур отклонений от основных показателей таблицы используют дополнительные тесты: реакции с метилротом и Фогес-Проскауэра, наличия образования оксидазы, определение подвижности и др.
СХЕМА
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА НА СМЕШАННУЮ КИШЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ
4. Серологическая идентификация культур бактерий
4.1. Серологическую идентификацию культур эшерихий и сальмонелл проводят в соответствии с действующими «Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» и «Методическими указаниями по лабораторной диагностике сальмонеллезов человека и животных, обнаружению сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды». Культуры названных бактерий относят к возбудителям болезни на основании показателей, указанных в этих методических указаниях.
Источник
РЕКОМЕНДОВАНЫ 25 июля
1978 г., б/н
1.
Общие положения
1.1. Настоящие
Методические указания распространяются на следующие вирусные
респираторно-кишечные инфекции (пневмоэнтериты) крупного рогатого
скота: инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3), вирусную
диарею (ВД), аденовирусную инфекцию (адено),
респираторно-синцитиальную инфекцию (PC), грипп.
1.2. Лабораторная
диагностика вирусных респираторно-кишечных инфекций заключается
в:
—
обнаружении антигена в патологическом материале методами
иммунофлуоресценции (ИФ), реакции связывания комплемента (РСК),
реакции диффузионной преципитации (РДП);
—
выделении возбудителя из патологического материала в культуре
клеток или на куриных эмбрионах и его идентификации в одной из
серологических реакций: РСК, РДП, реакции торможения
гемагглютинации (РТГА), реакции торможения гемадсорбции, (РТГАд),
реакции нейтрализации (РН), реакции торможения непрямой
гемагглютинации (РТНГА), ИФ;
—
выявлении антител в крови больных и переболевших животных
(ретроспективная диагностика) в одной из серологических реакций:
реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), РДП, РН, РТГА, РСК,
реакции нейтрализации вирусных гемагглютининов (РНВГ).
1.3. Схема исследований
при лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных
инфекций крупного рогатого скота (см. стр.209, 210).
1.4. При лабораторной
диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного
рогатого скота используют соответствующие каждой инфекции
диагностические наборы, выпускаемые биологической
промышленностью.
1.5. Диагностика вирусных
пневмоэнтеритов проводится параллельно с исследованием материала на
бактериальные и хламидийную инфекции.
1.6. Лабораторный диагноз
на вирусные респираторно-кишечные инфекции ставится на основании
положительных результатов обнаружения антигена в патологическом
материале с помощью одной из серологических реакций (ИФ, РДП, РСК)
или выделения и идентификации возбудителя в одной из реакций,
указанных в схеме п.1.3, или установления четырехкратного прироста
антител в крови переболевших животных.
Болезнь | Обнаружение | Выделение | Идентификация вируса (реакция) | Ретроспек- | |
исследуемый | реакция | ||||
Инфекционный | Слизистая | ИФ, РДП | В культуре клеток: ПЭК, ПТ, ТБ, СЭК | ИФ, РН | РНГА, РДП, |
Парагрипп-3 | Слизистая | ИФ | В культуре клеток: ПЭК, ПТ, ТБ, ЛЭК, СЭК | ИФ, РТГА, РГАд, | РНВГ |
Вирусная | Слизистая | ИФ | В культуре клеток: СЭК, ПЭК, ТБ | ИФ, РСК, РДП, | РСК, РН |
Аденовирусная | То же | ИФ, РСК | В культуре клеток: ПЭК, ТБ | ИФ, РСК, РДП, | РНГА, РДП, |
Респираторно- | Слизистая | ИФ | В культуре клеток: ПЭК, ТБ | ИФ, РДП, | РДП |
Грипп | То же | ИФ | На куриных эмбрионах | РТГА | РТГА |
Обозначения: ПЭК —
почка эмбриона коров; ПТ — почка телят; ТБ — тестикулы бычков; СЭК
— селезенка эмбриона коров; ЛЭК — легкие эмбриона коров.
Диагноз на вирусные
пневмоэнтериты считают установленным по результатам лабораторного
исследования с учетом эпизоотологических и клинических данных и
патологоанатомических изменений.
1.7. Для постановки
лабораторного диагноза путем обнаружения антигена в патологическом
материале требуется 2…3 дня, с помощью выделения вируса и его
идентификации — до 30 дней, а путем выявления прироста антител в
крови животных — от 2 до 4 недель.
2.
Взятие и подготовка материала для исследования
2.1. В лабораторию для
исследования направляют патологический материал от больных
животных, взятый в период максимального проявления у них
клинических признаков (температурная реакция, угнетение,
воспалительные процессы в верхних дыхательных путях,
сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой
полости, поносы, иногда аборты), или от вынужденно убитых или
павших животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их
гибели.
2.2. От больных животных
берут: 1) тампонами мазки со слизистой носовой полости (при ИРТ —
со слизистой глаз, влагалища, препуция) для реакции
иммунофлуоресценции и для выделения возбудителя; 2) фекалии — для
выделения возбудителя и 3) пробы крови — для выявления в ней титра
антител.
Тампоны с материалом
помещают в пенициллиновые флаконы с 2…5 мл питательной среды для
культуры клеток или раствора Хенкса, содержащие 1000 ЕД/мл
пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина.
Кровь в объеме не менее
5,0 мл берут в пробирки, после свертывания доставляют в
лабораторию.
2.3. От павших и
вынужденно убитых животных берут кусочки носовой перегородки,
трахеи, легких, селезенки, почки, средостенные и брыжеечные
лимфатические узлы и при поносах — кусочки тонкого отдела
кишечника. От абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных
органов, околоплодную жидкость.
2.4. Флаконы с
патологическим материалом доставляют в лабораторию в термосе со
льдом.
2.5. В лаборатории
флаконы с тампонами встряхивают 2…3 мин, тампоны отжимают и
удаляют, а содержимое флакона центрифугируют при 2 тыс. об/мин в
течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную
пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл
стрептомицина, выдерживают при 4°С в течение 2…4 ч и используют
для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов. Из осадка
центрифугата готовят мазки для исследования методом
иммунофлуоресценции.
2.6. Флаконы с фекалиями
замораживают при температуре -20°С (в морозилке холодильника) в
течение 18 ч, после чего оттаивают при 37°С и центрифугируют при 5
тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в
стерильную пробирку, вносят 1000 ЕД/мл пенициллина, 1000 мкг/мл
стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина, выдерживают при 4°С в течение
2…4 ч, дополнительно центрифугируют и используют для заражения
культуры клеток или куриных эмбрионов.
2.7. Со слизистой носовой
перегородки, трахеи, влагалища, бронхов и кишечника делают
скальпелем соскобы, вносят их в центрифужную пробирку с 5 мл
физиологического раствора и центрифугируют при 2 тыс. об/мин в
течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в 0,5 мл того же
раствора и готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах для
исследования методом иммунофлуоресценции.
Из кусочков легкого и
лимфатических узлов готовят отпечатки на предметных стеклах или
срезы толщиной 5 микрон для исследования тем же методом.
2.8. Из кусочков органов
готовят 10…20%-ную суспензию для выделения возбудителя и
приготовления комплементсвязывающего и преципитирующего
антигенов.
2.9. Для получения
суспензии (с целью выделения вируса) ткань измельчают, растирают в
ступке со стеклянным песком, разводят раствором Хенкса, содержащим
антибиотики, центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин.
Надосадочную жидкость отсасывают, выдерживают при температуре 4°С в
течение 2…4 ч и используют для заражения культуры клеток или
куриных эмбрионов.
2.10. Для изготовления
испытуемого комплементсвязывающего антигена ткань измельчают в
ступке или специальном микроизмельчителе, разводят 1:5 содержащим
антибиотики физиологическим раствором, рН 7,2…7,4. Полученную
20%-ную суспензию замораживают при температуре -20°С в течение
16…18 ч, быстро оттаивают при температуре 37°С, повторно
растирают или гомогенизируют, а затем центрифугируют при 5 тыс.
об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и далее
используют, как указано в п.5.1.
3.
Обнаружение вирусных антигенов в патологическом материале методом
иммунофлуоресценции
3.1. Метод
иммунофлуоресценции для обнаружения вируса применяется при
диагностике всех респираторно-кишечных инфекций, указанных в
п.1.1.
3.2. Полученные мазки,
отпечатки и срезы подсушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в
течение 5 мин и окрашивают флуоресцирующими сыворотками, имеющимися
в наборах диагностикумов. Каждой сывороткой окрашивают по 4
препарата из каждого органа.
3.3. Окрашивание
препаратов ведут во влажной камере при температуре 37°С в течение
45 мин. Затем препараты споласкивают в трех сменах физиологического
раствора, рН 7,2…7,4, и в дистиллированной воде, подсушивают на
воздухе. На препараты наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют
их под люминесцентным микроскопом.
3.4. Для контроля
специфичности свечения ставят реакцию подавления
иммунофлуоресценции. Для этого на два препарата из органа, при
исследовании которого получена положительная реакция
иммунофлуоресценции, наносят соответствующую выявленному вирусу
сыворотку в разведении 1:10 и выдерживают их в термостате во
влажной камере в течение 30 мин.
Препараты споласкивают в
трех сменах физиологического раствора, рН 7,2…7,4, и окрашивают
флуоресцирующей сывороткой.
3.5. Учет реакции.
Положительным результатом исследования методом ИФ считается наличие
специфической флуоресценции, которая характеризуется тем, что в
препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой, ткань
флуоресцирует тусклым зеленовато-серым цветом, а вирусный антиген
при этом выявляется в виде ярких зеленовато-желтых различных по
величине гранул или в виде диффузного свечения в цитоплазме или
(при ИРТ, адено) в ядре.
В
контрольных препаратах, обработанных последовательно специфической
и флуоресцирующей сыворотками, специфическая флуоресценция должна
отсутствовать.
Диагноз на вирусную
респираторно-кишечную инфекцию ставят при обнаружении специфической
флуоресценции не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом
из них 3…5 и более флуоресцирующих клеток или при наличии
15…20% флуоресцирующих клеток при подсчете не менее 100 клеток в
препарате. При выявлении меньшего числа флуоресцирующих клеток
диагноз подтверждают исследованием антител в парных пробах
сывороток крови больных животных или выделением возбудителя.
3.6. При исследовании
материала от животных, привитых живыми вакцинами против инфекций,
на которые проводятся диагностические исследования, положительные
результаты ИФ во всех случаях следует подтверждать исследованием
парных проб сывороток крови.
4.
Обнаружение антигена вируса ИРТ в РДП
4.1. РДП ставят в
агаровом геле.
4.2. Компоненты реакции:
специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная
сыворотка; исследуемый материал от больных животных; специфический
антиген.
4.3. Агаровую среду
готовят по прописи: агар — 1,0, физиологический раствор рН 7,4 —
100,0 мл. Агар расплавляют на водяной бане и разливают в чашки
Петри по 25 мл или на обезжиренные предметные стекла. В слое
застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки — одну
центральную и 6 вокруг нее на расстоянии 0,5…0,7 см.
4.4. Постановка реакции.
В центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в лунки по
окружности — испытуемый материал. Параллельно испытуемый материал
исследуют с отрицательной сывороткой.
Контроли:
1) контрольный
положительный антиген + специфическая сыворотка;
2) контрольный
положительный антиген + отрицательная сыворотка.
Чашки Петри или
предметные стекла помещают во влажную камеру, выдерживают при
температуре 37°С в течение 18…24 ч и затем при комнатной
температуре в течение такого же времени.
4.5. Учет реакции.
Реакцию считают положительной при условии образования ясно
выраженной линии преципитации между лунками с исследуемым антигеном
и специфической сывороткой, а также между контрольным положительным
антигеном и специфической сывороткой при отрицательном результате с
отрицательной сывороткой.
5.
Обнаружение антигена адено в патологическом материале в РСК
5.1.
Комплементсвязывающий антиген готовят из 20%-ной суспензии
патологического материала, обработанной, как указано в п.2.10. Для
этого к ней добавляют 1%-ный раствор гексаметафосфата натрия до
конечной концентрации 0,05% и раствор 1 н. НСl для снижения рН до
4,1.
Смесь оставляют на 30
мин, а затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин.
Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в 1/20
первоначального объема суспензии 0,1 М (моль/л) фосфатно-буферного
раствора, рН 7,9, содержащего 0,85% хлористого натрия. Полученный
раствор осветляют центрифугированием при том же режиме и исследуют
в РСК с иммунными сыворотками к аденовирусу крупного рогатого
скота.
5.2. Компоненты реакции:
испытуемый антиген; два стандартных специфических антигена,
относящиеся к двум антигенным подгруппам; отрицательный антиген;
две специфических сыворотки, соответствующие антигенным подгруппам;
нормальная сыворотка.
5.3. Испытуемый антиген
исследуют в двукратных разведениях, остальные антигены и сыворотки
— в удвоенном титре.
5.4. Постановка реакции.
Реакцию ставят в пробирках в объеме 0,5 мл или используют
микротитратор Такачи. РСК проводят в три этапа: титрование
комплемента в чистом виде, титрование комплемента в присутствии
антигенов и сывороток, главный опыт.
5.5. Для титрования
комплемента во вспомогательном ряду пробирок готовят различные дозы
по следующей схеме:
Компоненты, | Искомые дозы | |||||
0,16 | 0,19 | 0,22 | 0,25 | 0,28 | 0,31 | |
Комплемент | 0,16 | 0,19 | 0,22 | 0,25 | 0,28 | 0,31 |
Физиологический раствор | 0,34 | 0,31 | 0,28 | 0,25 | 0,22 | 0,19 |
Комплемент титруют по следующей схеме:
Компоненты, | Искомые дозы | |||||
0,16 | 0,19 | 0,22 | 0,25 | 0,28 | 0,31 | |
Комплемент в | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Физиологический раствор | 0,2 | |||||
Источник
