Дерябин п г гепатит с
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется для лечения вирусного гепатита С. Препарат для лечения вирусного гепатита С, включающий экстракт бересты с содержанием бетулина более 70% и фармацевтически приемлемый носитель. Препарат вводят пациенту перорально. Препарат способствует эффективному лечению вирусного гепатита С. 3 н.з. п. ф-лы, 2 табл.
Область техники
Настоящее изобретение относится к области медицины, а более конкретно относится к изысканию новых, эффективных средств лечения гепатита С.
Уровень техники
Вирусные гепатиты относятся к категории наиболее опасных и распространенных инфекционных заболеваний. Ежегодно в мире от патологий, связанных с этой болезнью, умирают около 2 миллионов человек.
Причиной возникновения вирусных гепатитов являются, по крайней мере, 5 различных вирусов — энтеральные вирусы А и Е и парентеральные (В, С, Д).
Вирус гепатита С является самым «молодым», он был открыт лишь в 1989 году. С его открытием началось интенсивное изучение этой разновидности гепатита, являющейся основной причиной развития хронических диффузных заболеваний печени и гепатоклеточной карциномы.
Отличительной особенностью вируса гепатита С является способность к длительному персистированию в организме, что обуславливает высокий уровень хронизации инфекции (50-80% случаев). Устойчивость вируса обусловлена его способностью реплицироваться с высоким уровнем «мутации», в результате чего возникает несколько иммунологически различающихся вариантов, благодаря которым вирус избегает иммунного надзора. Образующиеся вируснейтрализирующие антитела являются высокоспецифичными и не способны нейтрализовать вновь появляющиеся варианты вируса.
Крайне высокий уровень заболеваемости вирусным гепатитом и, в частности, гепатитом С обуславливает актуальную задачу изыскания и создания эффективных средств терапии этой инфекции.
В настоящее время в практической медицине официально известно два препарата, используемых для лечения вирусного гепатита С (интерферон и рибавирин или виразол), однако это не делает задачу изыскания новых средств лечения этого заболевания неактуальной, в частности, из-за побочных эффектов, которые сопровождают применение известных препаратов, таких как развитие анемии, нейтропении, лейкопении, диспептические явления.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является изыскание нового, высокоэффективного средства для лечения гепатита С.
Другой задачей настоящего изобретения является изыскание высокоэффективного средства для лечения гепатита С природного происхождения, поскольку при этом отпадает целый ряд проблем, сопутствующих применению химиопрепаратов.
Указанные задачи решены настоящим изобретением благодаря установлению авторами высокой противовирусной активности по отношению к вирусу гепатита С у экстракта березовой коры (бересты) с содержанием бетулина в экстракте свыше 70%.
Бетулин является одним из первых природных веществ, которое впервые было выделено из растительного сырья еще в 1778 году. В 1876 году У.Хаусманн опубликовал результаты элементарных анализов бетулина (Hausmann U., Annalen der chemie, 182, р.365).
Основным источником природного бетулина является береза. Белая часть березовой коры у отдельных видов березы (Betula verrucosa, Betula papyfera) содержит до 30% и более бетулина (Hayek, E.W. et al.(1989) A Bicentenmal of Betulin, Phytochemistry, 28(9) р.2229-2242).
Бетулин является пентациклическим тритерпеном с углеродным скелетом ряда лупана, который также называют бетулинолом, трохотоном, березовой камфарой и (корили-) резинолом. Характерной особенностью ряда лупана является кольцо с пятью атомами углерода в составе пентациклической системы, которое в положении С-19 имеет -изопентениловую группу. Бетулин отличается высокой термостабильностью, его температура плавления находится между 250 и 261°С, причем после сублимации рекристаллизованного продукта достигаются еще более высокие значения. Его молекулярный вес составляет 442,7, он растворим в пиридине и тетрагидрофуране, но мало растворим в дихлорметане, хлороформе и холодных органических растворителях, причем с повышением температуры его растворимость значительно возрастает. В воде и холодном петролейном эфире бетулин практически не растворим. Кроме того, кинетические исследования показали очень низкую реакционную способность гидроксильных групп бетулина.
Еще в 1899 году Дж.Уилер показал антисептические свойства бетулина, и поэтому он использовался для стерилизации перевязочных бинтов и пластырей (Wheeler J., (1899), Pharm. J., Die Darstellung des Betulin durch Sublimation, 494, Ref. Chem. Centr. 1900 I, стр. 353). В натуропатии и народной медицине получали и получают до сих пор отвары березовой коры, которые применяют для лечения малярии, водянки, подагры и при кожных заболеваниях, а также в виде настойки для компрессов при лечении абсцессов.
Большое число исследований посвящено гепатопротекторной активности бетулина. Было обнаружено, что бетулин снижает активность аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, содержание малеинового диальдегида, предупреждает воспалительный процесс в печени (Ю.К.Василенко и др. «Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы» Экспериментальная и клиническая фармакология, 1993, т.54 №4 стр. 53-55).
Однако не имеется достоверных сведений о противовирусной активности бетулина, в отличие от его различных синтетических производных. Так, сообщалось, что 3-замещенные глютариловые производные бетулина in vitro обладают цитотоксичностью в отношении лимфоцитов, трансформированных HIV («Synthesis and anti — HIV activity of betulin derivaties», Bioorg Med Chem Lett. 1998 May 19, 8(10) p.1267-1272).
Большое число публикации посвящено получению целого ряда производных бетулиновой кислоты как потенциальных средств борьбы со СПИДом (см. например, «Synthesis and anti — HIV activity of betulinic acid and dihidrobetulinic acid derivaties», Bioorg Med Chem lett, 1997, Dec 5(12) p.2133-2143).
Возможность применения производных бетулина исследовалась и в отношении гепатита на моделях гепатита не вирусного происхождения, вызванного Cll 4, тетрациклином и ацетоном. (О.Б.Флехтер «Синтез эфиров тритерпеноидов группы лупана и их гепатопротекторная активность», Биоорганическая химия, 2000, том 26, №3, стр. 215-223).
Раскрытие изобретения
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что экстракт коры березы обладает антивирусными свойствами. Этот эффект был обнаружен на модели экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С человека в организме мышей.
Несмотря на то, что антивирусная активность производных бетулина была показана рядом авторов на модели ВИЧ инфекции in vitro, неожиданность этого результата обусловлена не только тем обстоятельством, что предыдущие исследования бетулина не обнаруживали у него и у его производных противовирусной активности в отношении вирусного гепатита С, но и тем, что сами авторы изобретения при исследовании экстракта березовой коры в культурах клеток (in vitro) не обнаружили у него этой активности. Она проявилась лишь в условиях in vivo.
Осуществление изобретения
Далее описаны результаты исследований влияния экстракта березовой коры на репродукцию вируса гепатита С (далее сокращенно ВГС) в организме лабораторных животных.
Материал и методы:
Вирус: В работе использовали цитопатогенный вариант ВГС, выделенный из сыворотки крови хронически инфицированной ВГС больной. По данным генотипирования изолированный вариант ВГС относится к наиболее распространенному в России генотипу 1b ВГС. В исследованиях использовали инфекционные дозы ВГС, равные 10,0 ТЦД 50.
Противовирусный препарат. В работе использовали экстракт с содержанием бетулина, определенным методом ВЭЖХ — 72%. В опыте использовали различные разведения от 50 до 150 мг на 1 кг веса, которые вводили животным пероральным способом ежедневно в течение 4 дней.
Животные. Для изучения противовирусной активности бетулина использовали белых беспородных половозрелых мышей массой 18-20 г.
Методы. Материал, содержащий ВГС, вводили животным внутрибрюшинным способом. Часть животных оставляли контрольными. На 9-й день после заражения мышей “кормили” (вводили пероральным способом) раствором бетулина (физиологический раствор, с 10% Твина-80) (здесь и далее под бетулином понимается описанный выше препарат) в объеме 50 мкл, содержащих 50, 100 и 150 мг бетулина. Бетулин давали мышам 1 раз в день в течение 4-х дней. В опыте использовали по 10 животных на каждый вариант опыта. Через 2 дня, а также через 10 дней после последнего введения препарата, по 50% животных вскрывали, извлекали печень, головной мозг, забирали кровь. Пробы сывороток крови, надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин гомогенатов ткани печени и головного мозга использовали для определения антигенов ВГС и инфекционной активности вируса гепатита С. С этой целью вируссодержащие пробы титровали в культурах перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи СПЭВ. Антиген ВГС в данных пробах изучали в реакции гемагтлютинации, используя классический метод, описанный Clarke и Casals (1968).
Культуры клеток. Были использованы высоко чувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные из фирмы “Нарвак”, Москва. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с 10% сыворотки эмбриона телят, с добавлением глютамина и антибиотиков (100 ЕД/мл). Для титрования остаточной инфекционной активности вируса использовали ту же линию клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ).
Инфекционную активность ВГС, содержащегося в пробах органов и тканей инфицированных мышей, учитывали по результатам титрования, как правило, на 6-7 день после инфекции, когда развивалось максимальное цитопатогенное действие вируса, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра вируса гепатита С.
Результаты.
Данные исследований приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из данных табл. 1а, все пробы сывороток крови, полученных от ВГС инфицированных мышей, относящихся к различным группам, содержат как антигенную, так и инфекционную активности ВГС. Причем максимальные проявления этих показателей обнаружены в контрольной группе ВГС инфицированных животных, не получавших бетулин. У животных, получавших препарат в дозе 50 мг на 1 кг веса в 50 мкл, была отмечена заметная тенденция к снижению титров гемагглютинина ВГС, а инфекционные титры ВГС в сыворотке крови падали на 2,6 lg (средние данные). Значительное снижение антигенной и инфекционной активностей ВГС в сыворотке крови отмечали в группе животных, получавших ежедневно препарат “бетулин” в дозе 100 мг/кг. В этом случае титры инфекционной активности ВГС падали на 3,4 lg и более чем в 2 раза снижалась антигенная активность ВГС в пробах сыворотки крови мышей. В меньшей степени препарат проявлял активность в случае использования его в дозе 150 мг/кг. Снижалась антигенная активность вируса, титры инфекционной активности незначительно снижались под влиянием препарата (на 1,8 lg). Близкие результаты, свидетельствующие об эффективности препарата “бетулин”, были получены при изучении тканей печени от всех групп животных (табл.1б). В частности показано, что максимальное снижение антигенов ВГС и его инфекционной активности наблюдали в случае использования препарата в разовой дозе 50 и 100 мг на 1 кг веса при 4-кратном введении препарата. Из данных таблицы 1б видно, что антигенная активность ВГС при этом снижалась в 2 и более раз и до 2 lg отмечали снижение инфекционной активности ВГС в тканях печени. Сокращались и размеры печени ВГС инфицированных мышей под влиянием лечебного эффекта препарата Наибольшие титры ВГС (до 7,0 lg ТЦД50 /20 мкл) наблюдали в тканях головного мозга ВГС инфицированных мышей (таблица 1 в). Однако и в этом случае у мышей, получавших препарат “бетулин” в дозах 50 и 100 мг на 1 кг наблюдали снижение титров инфекционной активности ВГС на 2,0-2,5 lg соответственно. При этом снижение антигена ВГС отмечали во всех группах животных, получавших препарат. В группе мышей, получавших бетулин в дозе 150 мг на 1 кг, отмечена тенденция к увеличению титров инфекционной активности ВГС в головном мозге.
Таким образом, данные, полученные при изучении органов и тканей мышей на 17 день после инфекции ВГС и 3-й день после 4-кратного применения препарата “бетулин”, свидетельствуют о высокой противовирусной активности препарата в отношении инфекции, вызванной ВГС у животных.
В этой связи выявлялась продолжительность положительных изменений в организме ВГС инфицированных мышей после отмены препарата. Поэтому 2-я группа ВГС инфицированных животных была обследована на 28 день после инфекции и на 11 день после отмены лечения препаратом “бетулин”.
Полученные результаты приведены в таблицах 2а, б, в. Исследование антигенной активности ВГС в органах и тканях мышей в этот период времени позволило установить, что лечение препаратом “бетулин” в дозах 50 мг и 100 мг на 1 кг, как правило, приводило к значительному снижению содержания гемагглютинина ВГС в пробах сыворотки крови, печени и головного мозга ВГС инфицированных животных (в дозе 100 мг на 1 кг до 4 раз — в печени мышей, в 2 и более раз — в сыворотке крови и головном мозге животных). Доза препарата, равная 150 мг на 1 кг, как правило, приводила к незначительному снижению содержания антигена ВГС в органах и тканях животных, инфицированных ВГС.
Изучение инфекционной активности ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных мышей показало, что в отдаленные сроки после завершения лечения антивирусный эффект введенного препарата сохранялся в течение более чем 10 дней. Однако анализ полученных данных позволил обнаружить иные закономерности в параметрах инфекции ВГС в эти сроки. В частности, показано, что титры ВГС, содержащиеся в сыворотке крови и в печени контрольной группы животных в значительной степени превышали эти значения, выявленные в ранние сроки после заражения мышей (на 1,5 lg — в сыворотке крови, на 2,4 lg — в печени). В то же время, на 28-й день после инфекции в тканях головного мозга титры вируса стали заметно снижаться.
Противовирусный эффект препарата “бетулин” в эти сроки после отмены препарата был несколько снижен, однако наибольший эффект наблюдался в период, когда для лечения использовали дозу, равную 50 мг на 1 кг веса. В этом случае в сыворотке крови животных титры вируса снижались в среднем на 1,9 lg, в печени — на 2,9 lg, в головном мозге — на 2,4 lg. 4-кратное введение препарата “бетулин” в дозе 100 мг на 1 кг приводило к менее существенным изменениям титра ВГС в сторону уменьшения (см. таблицы.2а, б, в).
Таким образом, установлено положительное действие препарата “бетулин” на снижение показателей инфекции, вызванной ВГС у мышей, и через 10 дней после его отмены.
Полученные авторами изобретения результаты позволяют утверждать, что экстракт березовой коры обладает высокой антивирусной активностью в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С, что позволяет предлагать его в качестве средства для лечения этого вида гепатита.
При этом нет оснований утверждать, что содержание бетулина в экстракте не менее 70% является критическим и ограничивать им объем изобретения. Практически значимые результаты могут быть получены и при меньших значениях содержания бетулина. Установление этих граничных значений может быть осуществлено специалистами при проведении обычной рутинной работы, в частности, основываясь на изложенном выше в описании настоящего изобретения.
Предпочтительной формой применения экстракта бересты являются твердые лекарственные формы: таблетки, пилюли, капсулы, порошки. При этом могут использоваться обычные для этого вида фармацевтически приемлемые носители. Препарат может включать один или несколько наполнителей, таких как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, сахара, крахмалы, маннит, сорбит и другие полиолы, карбонат кальция, фосфат кальция, сульфат кальция, полиэтиленгликоли и др.
Препарат также может включать поверхностно-активные вещества и другие обычные компоненты для твердых фармацевтических препаратов, такие как красители, ароматизаторы, адсорбенты.
При изготовлении препарата в виде таблетки с покрытием последнее может быть получено из таких пленкообразующих веществ как гидроксипропилцеллюлоза, пластификатора, такого как полиэтиленгликоли, и других вспомогательных добавок таких как, например, пигменты.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение экстракта бересты в качестве средства для лечения вирусного гепатита С.
2. Препарат для лечения вирусного гепатита С, включающий экстракт бересты с содержанием бетулина более 70% и фармацевтически приемлемый носитель.
3. Способ лечения вирусного гепатита С, характеризующийся тем, что пациенту перорально вводят препарат по п.2.
Источник
Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской вирусологии, и касается способов ускоренной диагностики гепатита С. Сущность изобретения включает выявление антигенов вируса гепатита С(ВГС) в крови людей, зараженных или подозрительных на заражение вирусом гепатита С, основанное на способности антигенов ВГС агглютинировать эритроциты гусей или голубей в реакции гемагглютинации. Результаты считаются положительными, если титры антигенов ВГС в РГА превышают 1:20 — 1:40. Второй вариант включает выявление в крови этих людей индуцируемых гемагглютининами ВГС антител, которые определяют в реакции торможения гемагглютинации. Преимущество изобретения заключается в ускорении и упрощении способа диагностики. 2 с. и 3 з.п.ф-лы, 4 табл.
Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к методу диагностики гепатита С, основанному на прямом выявлении вирусспецифических антигенов и антител к природным белкам ВГС и приспособленным для массовых ускоренных анализов проб крови больных гепатитом С с возможной автоматизацией процесса.
Существующий в настоящее время метод специфической диагностики гепатита С основан на двух тестах: метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления последовательностей РНК-генома ВГС в сыворотке крови ВГС- инфицированных больных и иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антител к рекомбинантным структурным и неструктурным белкам ВГС. В редких случаях для диагностики гепатита С используют биопсию печени.
В то же время известно, что оба этих метода имеют существенные недостатки: 1) метод ПЦР, как правило, дает отрицательные результаты в первые 6 месяцев после инфекции ВГС. Кроме того, ПЦР — дорогостоящий метод, требующий высокой квалификации специалистов, дорогостоящего оборудования, праймеров и реактивов, и поэтому имеет существенные ограничения в использовании его для массового скрининга образцов крови; 2) ИФА позволяет определять специфические антитела к ВГС в крови инфицированных больных. В качестве антигенов в этой реакция используют рекомбинантный нуклеокапсидный белок ВГС и один или несколько рекомбинантных неструктурных белков ВГС. Отсутствие полного набора ВГС-специфических природных белков в этой реакции, в частности поверхностных белков вирионов ВГС — Е2 и Е1, в значительной степени снижает ее чувствительность и часто приводит к отрицательным результатам при исследовании сывороток крови от ВГС-инфицированных больных.
Кроме того, до настоящего времени не разработаны способы прямого определения антигенов, агглютинирующих эритроциты и антигемагглютининов к ВГС в сыворотках крови инфицированных людей, что является необходимым для оценки динамики развития и тяжести инфекции ВГС у инфицированных людей, для оценки специфической и неспецифической противовирусной активности лечебно-профилактических препаратов До сих пор нет коммерческих тест-систем для обнаружения ВГС-специфических антигенов в сыворотках крови людей и антител к природным, в том числе поверхностным белкам ВГС.
Из литературных данных известны попытки определить ВГС-специфические антигены в крови больных. Антигены ВГС в этих случаях определяют после концентрации больших объемов сыворотки крови с помощью моноклональных антител к рекомбинантному нуклеокапсиду ВГС (Кущ А.А. и др. 1997). Ясно, что этот метод не может получить широкого внедрения в практическое здравоохранение. Известны также данные определения антигенов ВГС методом иммунофлюоресценции и ИФА при биопсии печени больных гепатитом С. Однако и этот метод имеет серьезные ограничения использования его для массового скрининга сывороток крови людей.
Ограниченность существующих методов диагностики гепатита С, прежде всего, связана с отсутствием до настоящего времени экспериментальных моделей in vitro и in vivo, которые позволили бы выделять высокопродуктивные антигенно-активные штаммы вируса гепатита С, пригодные для конструирования экономически выгодных диагностических систем.
Возможность создания экспериментальных моделей инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток различного происхождения и в организме инфицированных животных, реализованная нами ранее, позволила выделить из сыворотки крови людей, инфицированных вирусом гепатита С, высокопродуктивные антигенно-активные варианты вируса гепатита С, изучить их основные свойства и разработать до сих пор неизвестные для ВГС методы диагностики вызываемой им инфекции (П. Г. Дерябин и др., 1997, 1998). Штамм вируса гепатита С (Д-1), выделенный нами из культур клеток, пригодный для приготовления диагностических и профилактических препаратов (патент РФ на изобретение 2130967, приоритет от 07. 10.97 г.).
Предложенный способ определения антигенов ВГС основан на способности выявления в крови людей, инфицированных ВГС, антигенов ВГС, обладающих гемагглютинирующей способностью. Гемагглютинины ВГС были обнаружены нами при культивировании ВГС-содержащего материала в культурах клеток различного происхождения, а также в органах и тканях ВГС-инфицированных животных. Как известно, для других представителей семейства Flaviviridae гемагглютинирующая (ГА) активность флавивирусов связана с эпитопами на поверхности белка Е. Результаты исследований показали, что ВГС и все известные генотипы этого вируса, культивируемые в культурах клеток или на уровне организма, как и другие представители семейства Flaviviridae, способны агглютинировать эритроциты при различных значений рН фосфатного буфера. При этом ГА-активность ВГС специфически тормозится в присутствии антител (антигемагглютининов) к ВГС. Это свойство, характерное для многих представителей вирусов семейства Flaviviridae, на протяжении многих лет используется для диагностики флавивирусных инфекций в реакциях РГА и в РТГА, предложенными Clarke и Casals в 1958 г. В отношении вируса гепатита С эти методы определения антигенов и их специфической активности до сих пор не применялись.
В табл.1 представлены данные, демонстрирующие ГА- активность высокопродуктивных вариантов ВГС, выделенных из сыворотки крови больных гепатитом С методом заражения культур клеток различного происхождения.
Как видно из данных табл.1, ГА-активность изолированных вариантов ВГС проявляется при культивировании в культурах клеток различного происхождения. Данные показывают, что репликация ВГС в культурах клеток на всем протяжении сопровождается продукцией антигенов-гемагглютининов ВГС, которые регистрируются до появления цитодеструктивных свойств ВГС. Причем титры гемагглютининов ВГС для культур клеток варьируют и достигают максимальных значений к 72-96 ч после инфекции (1:64 — 1:128). А при коцентрации вируссодержащей культуральной жидкости, собранной из инфицированных культур клеток через 72 или 96 ч после инфекции, после центрифугирования ее при 30000 об/мин в течение 1 ч титры ГА-активность ВГС достигают 1:1024 — 1:2048. Показано, что ГА-активностью обладают все известные генотипы (субтипы) ВГС. Получены данные о ГА-активности антигенов, содержащихся в сыворотках крови, а также в различных органах и тканях мышей, кроликов, инфицированных цитопатогенными вариантами ВГС.
Полученные данные позволили предположить наличие антигенной активности ВГС в сыворотках крови инфицированных ВГС людей, обнаруживаемой по способности ВГС к гемагглютинации в классической реакции гемагглютинации (РГА).
Таким образом, в способе обнаружения антигенов ВГС была применена РГА, ранее известная для определения антигенов классических представителей альфа- и флавивирусов (вирусов восточного и венесуэльского энцефаломиелита лошадей, японского и клещевого энцефалитов, лихорадки Западного Нила, денге и др.) и до сих пор не использующаяся для обнаружения антигенов ВГС. Адаптация РГА для определения антигенов ВГС в сыворотках крови людей позволила обнаруживать ВГС-специфический антиген на всем протяжении инфекции, вызванной ВГС, в том числе и в случаях, когда данные высокочувствительного метода ПЦР были отрицательными, включая ранние сроки после инфекции. Определение антигенов ВГС в сыворотках крови людей оказалось наиболее чувствительным методом диагностики гепатита С у людей, использование которого позволяет в короткие сроки устанавливать диагноз инфекции. Простота постановки реакции позволяет использование ее для массового скриннинга проб крови людей на наличие инфекции, вызванной ВГС, для оценки эффективности лечения или профилактики гепатита С различными препаратами, для определения инфекции ВГС при отрицательных данных ПЦР. Показана возможность определения антигенов ВГС как в цельной крови, так и в сыворотках крови, во фракциях эритроцитов и лейкоцитов крови человека.
Сущность изобретения: основана на выявлени гемагглютинирующей способности антигенов вируса гепатита С. Пробы крови людей, подозрительных на инфекцию вирусом гепатита С, используют в качестве исследуемого антигенсодержащего материала в классической реакции гемагглютинации (РГА) в оптимальной зоне рН фосфатного буфера. Метод определения антигенов ВГС в крови людей позволяет количественно оценивать концентрацию (титры) антигенов (гемагглютининов) ВГС.
Специфичность гемагглютинирующей активности (ГА-активности) ВГС подтверждают в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в классической постановке (Clarke и Casals, 1958 г.). Способ обнаружения антител к вирусу гепатита С основан на возможности использования в РТГА в качестве специфических антигенов природных структурных белков вирионов вируса гепатита С, выделенного из культур клеток или органов животных, инфицированных цитопатогенным вариантом ВГС. Использование антигенно-активных природных белков и вирионов ВГС позволяет идентифицировать гемагглютинины в крови ВГС-инфицированных людей как антигены ВГС.
В реакции используют кровь или эритроцитарную или лейкоцитарную фракции крови, или сыворотку из крови человека, взятую в количестве до 100 — 200 мкл (0,1-0,2 мл). Затем сыворотку разводят до 1:10 боратным буферным раствором, содержащим 0,4% бычьего альбумина (рН 9,0). Используя тот же состав боратно-буферного раствора, делают 2-кратные разведения сыворотки, начиная с 1:10, 1: 20, 1:40 и т.д., в 96-луночных панелях с u-образным дном. Эритроциты гуся получают из подкрыльцовой вены гусей-самцов или голубей, используя антикоагулирующий раствор Альзовера. В реакции используют 0,4% взвесь эритроцитов на фосфатном буферном растворе (зона рН 6-7), который готовят перед опытом, смешивая фосфатно-буферные растворы рН 6 и 7.
По 20 мкл взвеси эритроцитов гуся вносят в каждую из лунок с разведениями сыворотки крови человека. В качестве контролей в РГА служат: а) 0,4% взвесь эритроцитов, внесенная в лунки с боратным буферным раствором без крови ВГС-инфицированных людей или с кровью заведомо здоровых доноров. Через 1 ч учитывают результаты. Образование плотного осадка эритроцитов на дне лунки свидетельствует об отрицательных результатах. Формирование «зонда» из агглютинированных эритроцитов на всей поверхности эритроцитов свидетельствует о положительной реакции. В контрольных опытах наблюдают формирование плотного осадка эритроцитов.
Учет результатов основан на подсчете титров антигена ВГС. Результаты считаются положительными, если титр антигенов ВГС в РГА превышает 1:20 — 1: 40.
Данный способ определения антигенов ВГС позволяет использовать минимальные объемы сыворотки крови ВГС инфицированных людей, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, а также высокой квалификации персонала.
Сущность предложенного способа определения антигемагглютининов заключается в получении культуральных, в том числе концентрированных и очищенных антигенов ВГС или антигенно-активного вируса, антигенов ВГС, полученных методом щелочной или сахарозоацетоновой экстракции — классические способы получения антигенов для большинства вирусных инфекций, описанные в литературе. Антигены ВГС, полученные таким образом, должны обладать высокой гемагглютинирующей активностью, что дает возможность их использования в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) для определения антигемагглютининов в сыворотках крови ВГС инфицированных людей. РТГА используется в классической постановке, описанной Clarke и Casals (1958 г.).
В табл.2 представлены данные, полученные в РТГА, о циркуляции в сыворотке крови ВГС инфицированных людей антигемагглютининов ВГС. В частности, показано, что антитела, тормозящие гемагглютинацию ВГС, циркулируют у людей в разные сроки после инфекции ВГС. В то же время антигемагглютинины в более высоких титрах обнаруживают в начале инфекции, когда данные ПЦР не позволяют обнаруживать РНК ВГС.
Полученные данные позволяют проследить динамику инфекционного процесса, а наличие антигемагглютининов в сыворотке крови людей позволяет обнаруживать инфекцию ВГС в ранние сроки или оценить действие лечебных препаратов на течение инфекции.
Пример 1. Способ определения антигенов — гемагглютининов ВГС в сыворотках крови людей. Табл.3, в РГА, поставленной микрометодом с использованием эритроцитов гуся в фосфатном буферном растворе были обследованы 145 образцов сыворотки крови людей, инфицированных ВГС, 182 образца сывороток от людей, не содержащих РНК ВГС и антител к ВГС. Из данных табл.3 видно, что все сыворотки от инфицированных ВГС содержали антигены ВГС, причем максимальные значения титров ГА активности наблюдаются у больных, сыворотки которых содержали как антитела, так и РНК ВГС. Значительно более низкие титры гемагглютининов (1:128 — средние данные) обнаруживали у людей, в сыворотке крови которых не выявлена РНК ВГС. Однако обнаруженная концентрация антигенов ВГС у таких больных (а это больные в ранние сроки после инфекции) дает возможность устанавливать диагноз инфекции в случаях, когда данные ПЦР являются отрицательными. Определение ГА-активности в образцах сывороток крови контрольных групп людей (182 образца) показало, что в среднем эти данные не превышают титров 1:18, что, как известно, скорее всего связано с неспецифическим проявлением ГА-активности у людей: доноров, больных гриппом, гепатитом В, пневмонией и краснухой.
Таким образом, РГА дает возможность быстрого выявления антигенов ВГС, агглютинирующих эритроциты гуся в сыворотках крови ВГС-инфицированных людей, положительных и отрицательных на РНК ВГС по данным ПЦР.
Пример 2. Способ определения антигемагглютининов ВГС в сыворотках крови людей. Возможность определения антител, тормозящих ГА-активность ВГС, появилась благодаря выделению из ВГС-инфицированных культур клеток антигенно-неактивных вариантов ВГС, которые и были успешно использованы в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В табл.4 представлены данные, демонстрирующие возможность РТГА для определения антител к ВГС в сыворотках крови инфицированных гепатитом С. Показано, что: — Антигемагглютинины ВГС циркулируют в сыворотках крови людей на разных стадиях инфекции ВГС.
— Максимальных значений антигемагглютинины достигают в сыворотках крови людей, содержащих антитела к ВГС (по данным ИФА), но отрицательных в ПЦР реакции (РНК ВГС отрицательные сыворотки). Вероятно, этим и объясняется низкий титр гемагглютининов ВГС, выявляемый в этих же сыворотках: ГА -активность в этом случае в значительной степени подавлена антителами к ВГС.
— Использование в РТГА в качестве антигенов ВГС сывороток крови ВГС-инфицированных людей, ВГС- инфицированных кроликов, а также культуральных антигенов ВГС позволяет выявлять антигемагглютинины во всех случаях, однако максимальные титры антител обнаруживаются при использовании культуральных антигенов (культуральная жидкость, собранная из инфицированных ВГС культур клеток, выращиваемых роллерным способом).
— Атигемагглютинины ВГС не были выявлены в образцах сывороток контрольных групп людей: доноров, больных гепатитом В, краснухой, гриппом, пневмонией, что ярко демонстрирует специфичность как антигемагглютининов ВГС, так и ГА-активности ВГС в сыворотках крови ВГС-инфицированных людей.
— ВГС-специфические рекомбинантные белки (нуклеокапсидный и неструктурные белки), входящие в состав коммерческих тест-систем, производимых фирмой «Органон» (США), не способны выявлять в РТГА антитела в сыворотках крови ВГС- инфицированных, что свидетельствуют о том, что ГА-активность ВГС связана с белками оболочки вириона, скорее всего с белком Е2, не входящим в состав данной тест-системы.
Источники информации 1. Clarke D.H. and Casals J. Techniques for haemagglutination and haemagglutination inhibition with arthropod borne viruses. Am. J.Trop. Med. Hyg. 7:562(1958).
2. Дерябин П.Г., Львов Д.К., Исаева Е.И., Вязов С.О. Штамм, virus hepatitis С, Д-1, для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Патент на изобретение 2130967, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 1999 г., Москва. Приоритет по заявке 97116620 от 07.10.1997 г.
3. П. Г. Дерябин, С.О. Вязов, Е.И. Исаева и др. Персистенция вируса гепатита С в культурах клеток головного мозга мышей-сосунков. Вопр. вирусол., 1997, Т.6., стр.254-258.
4. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Вязов С.О. и др. Хроническая инфекция культур клеток почки эмбриона свиньи, вызванная вирусом гепатита С. Вопр. вирусол.,1997, т.6., стр.259-263.
5. П.Г. Дерябин, Е.И. Исаева, С.О. Вязов, Д.К. Львов. Летальная инфекция новорожденных мышей, вызванная вирусом гепатита С. Вопр. вирусолог., 1997, т.6., стр.251-253.
6. П.Г. Дерябин, Д.К. Львов. Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентификация. Доклады Академии наук РФ, 1998, т.358, N5, стр.688-691.
7. А. А. Кущ, О. В. Масалова, С.Н. Атанадзе. и др. Материалы 2-й Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты B, C, D и G — проблемы диагностики, лечения и профилактики, Москва 14-16 октября 1997 г.
Формула изобретения
1. Способ ускоренной диагностики гепатита С, предусматривающий использование (исследование) крови людей, зараженных или подозрительных на заражение вирусом гепатита С, отличающийся тем, что обнаружение (выявление) антигенов вируса гепатита С (ВГС) основано на способности антигенов ВГС агглютинировать эритроциты гусей или голубей в реакции гемагглютинации (РГА), при этом результаты считаются положительными, если титры антигенов ВГС в РГА превышают 1: 20-1: 40.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию гемагглютинации ставят при рН 6,1-6,5.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве буферной смеси в РГА используют боратный буфер рН 9,0, содержащий 0,4% бычьего альбумина и смесь фосфатных буферов рН 6 и рН 7.
4. Способ ускоренной диагностики гепатита С, предусматривающий использование (исследование) крови людей, зараженных или подозрительных на заражение вирусом гепатита С, отличающийся тем, что выявляют индуцируемые гемагглютининами ВГС антитела в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве гемагглютининов для РТГА используют антигены цитопатогенных вариантов ВГС, выделенных из инфицированных культур клеток и/или из органов зараженных ВГС животных.
РИСУНКИ
Рисунок?
