Гепатит в с стволовыми клетками

В статье изложены результаты первой фазы клинических исследований эффективности аутотрансплантации гемопоэтических стволовых клеток больным хроническими гепатитами в стадии тяжелого фиброза печени. После стимуляции выхода предшественников гемопоэза в периферическую кровь «Нейпогеном» выделенные гемопоэтические стволовые клетки вводили в чревный ствол, что обеспечивало доставку трансплантированных клеток в печень как с артериальным, так и с венозным кровотоком. В качестве критериев оценки эффективности трансплантации наряду с клиническими и биохимическими показателями использовали результаты морфологического анализа (индекс гистологической активности) и им-муногистохимического окрашивания (выявление пролиферативной активности, выраженности активации миофибробластов и капил-ляризации синусоидов). Результаты исследования показали, что трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток в чревный ствол больным хроническим гепатитом в стадии тяжелого фиброза является безопасной процедурой. Через месяц после трансплантации улучшаются общее состояние больного, показатели функциональных проб печени, уменьшается выраженность некрозов и воспаления и происходят качественные структурные изменения в печени — значительно снижается пролиферация гепатоцитов, уменьшается число миофибробластов в паренхиме, что приводит к разрешению перисинусоидального фиброза и восстановлению нормального строения синусоидных капилляров. Полученные результаты позволяют сделать выводы о перспективности данного метода лечения для подавления прогрессирования гепатита и фиб-розирования печени и о высокой информативности иммуногисто-химических методов в оценке эффективности трансплантации.

Согласно современным представлениям, восстановление поврежденных тканей и органов взрослого организма осуществляется при участии низкодифференцированных или стволовых клеток. Основным источником стволовых клеток является костный мозг, способный генерировать клетки-предшественники для большого числа тканей организма. В экспериментах на животных была показана возможность стимуляции регенерации печени аутогенными стволовыми клетками костного мозга [1, 2] и аллогенными стволовыми клетками пуповинной крови [3]. Получены первые положительные результаты лечения заболеваний печени у людей — установлена высокая эффективность применения ал-логенных стволовых клеток пуповинной крови при лечении вирусных гепатитов [4]. Более того, стволовые клетки с фенотипом CD133+, полученные из крови больных и введенные в печень через воротную вену, в 2,5 раза ускоряли процесс регенерации печени после резекции опухоли [5]. Положительная динамика функциональных проб печени была отмечена в рамках первой фазы клинических исследований, когда больным хроническими гепатитами [5 человек] была проведена трансплантация аутогенных стволовых клеток с фенотипом CD34+ [6]. Таким образом, к моменту начала нашей работы имелись теоретические, экспериментальные и клинические предпосылки для проведения ограниченных клинических испытаний применения аутологичных гемопо-этических клеток в терапии хронических гепатитов.

Методика исследования

На первом этапе после тщательного анализа литературы нами был разработан протокол клинических исследований. Отличительными чертами разработанного протокола являются: 1) способ трансплантации стволовых клеток в печень; 2) критерии оценки эффективности трансплантации.

Выбор способа трансплантации

В экспериментах на животных для стимуляции регенерации печени стволовые клетки чаще всего вводят внутри-брюшинно или в селезёнку, из которой они через воротную вену поступают в печень. В протоколах клинических исследований по применению стволовых клеток при хронических гепатитах и после резекции печени клетки вводили либо в периферический кровоток [7] [при этом большая часть клеток диссеминировалась по организму), либо в воротную вену -в этом случае все клетки поступали в печень с венозной кровью [5, 6].

Целью нашего исследования было изучение возможности использования стволовых клеток в лечении не просто хронических гепатитов, а хронических гепатитов в стадии тяжелого фиброза и цирроза. В этой стадии у больных развивается портальная гипертензия, причем введение клеток в воротную вену на фоне портальной гипертензии может вызвать внутреннее кровотечение в месте введения иглы. Исходя из этого, мы предположили, что клетки безопаснее вводить не в воротную вену, а в артериальный кровоток. Причем стволовые клетки целесообразнее вводить не в печёночную артерию, а в чревный ствол [рис. 1), от которого отходят печёночная артерия, левая желудочная артерия и селезёночная артерия [рис. 2). В результате такого введения часть клеток сразу попадает в печень по общей печёночной артерии, а те клетки, которые ушли к желудку и селезёнке, могут попасть в печень с венозной кровью через воротную вену [рис. 3).

Преимуществом предложенного метода введения, по нашему мнению, является не только его безопасность, но и возможность воздействовать стволовыми клетками на разные участки печеночной дольки. Дело в том, что кровь в печень поступает по двум сосудам — воротной вене [венозная кровь от всех непарных органов брюшной полости) и печеночной артерии [артериальная кровь из аорты). Венозная кровь составляет до 80% всей крови, проходящей через печень, и из мелких портальных вен она напрямую поступает в синусоидные капилляры железы. Артериальная кровь, перед тем как попасть в синусоиды, снабжает питательными веществами и кислородом все структуры портальных трактов и, в частности, желчные протоки [8]. Даже при легком перипортальном фиброзе происходят изменения в желчных протоках, которые сначала приводят к их компенсаторной пролиферации [дуктулярной реакции), а в дальнейшем к дук-топении с нарушением экскреторной функции печени [9]. В предложенном нами методе стволовые клетки могут действовать как внутри дольки [с венозной кровью), так и в области портальных трактов [с артериальной кровью).

Критерии оценки эффективности трансплантации

Главным достоинством разработанного протокола являются методы оценки эффективности использования стволовых клеток в лечении хронических гепатитов. Они заключаются в том, что мы дополнительно ввели в шкалу оценки прижизненную морфологическую диагностику, которая является «золотым стандартом» диагностики хронических гепатитов. Ни в одном из трех клинических исследований [5-7] этот метод не был использован — эффективность оценивали по биохимическим показателям функции печени, что вызывало справедливую критику в адрес авторов со стороны оппонентов.

Кроме того, в протокол исследований, наряду с обязательным определением степени активности и стадии заболевания, были введены методы иммуногистохимической оценки: 1) пролиферативной активности клеток печени [по экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток, Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA); 2) активации миофибробластов [по экспрессии альфа-гладкомышечного актина, а-ГМА); 3] капилляризации синусоидов [по экспрессии CD34).

Уровень пролиферации позволяет судить о выраженности регенераторного ответа гепатоцитов на повреждение.

а-ГМА — это один из контрактильных белков гладкой мышцы, который в здоровой печени обнаруживается только в мышечных клетках сосудов печени. При хроническом повреждении печени происходит трансдифференцировка перисинусоидальных клеток печени в миофибробласты, которые усиленно синтезируют коллаген, что приводит к развитию фиброза. Маркером миофибробластов является а-ГМА. Появление а-ГМА-позитивных миофибробластов, таким образом, приводит к отложению новых волокон коллагена и прогрессированию фиброза.

CD34 — это гликопротеин, который находится на наружной поверхности мембраны эндотелиальных клеток и проге-ниторных кроветворных клеток. В частности, его используют при выделении стволовых кроветворных клеток в качестве их маркера. При морфологическом исследовании биопта-тов CD34 интересовал нас как маркер эндотелия синусои-дов печени. Дело в том, что эндотелий синусоидов печени отличается от эндотелия капилляров других органов. Во-первых, он фенестрированный, во-вторых, у него нет сплошной базальной мембраны, и поэтому на мембране эндотелиальных клеток нет молекулы CD34. CD34 появляется в эндотелии синусоидов только при так называемой капилляризации последних. В этом случае в пространстве Диссе откладывается коллаген [перисинусоидальный фиброз), формируется подобие базальной мембраны и нарушается диффузия веществ из крови к гепатоцитам. Таким образом, появление CD34 в синусоидах позволяет судить о нарушении гемодинамики в синусоидах печени.

Для проведения морфологического анализа биоптаты печени фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Иммуногисто-химическое окрашивание срезов печени проводили стреп-тавидин-биотиновым методом [10] с использованием коммерческих моноклональных антител к PCNA, а-ГМА, CD34 и визуализационных систем фирм DAKO [Дания] и NOVOCASTRA [Великобритания).

Отбор больных

Критерием включения пациентов в программу клинических исследований было, согласно утвержденному протоколу, наличие хронического токсического [этанолового) гепатита и тяжелого фиброза печени. В настоящий момент в клиническом исследовании находятся 3 пациента и отобрано еще 12. Все больные до включения в программу исследований прошли курс стационарного лечения, состоявший из гепа-тотропных препаратов [Урсосан, Карсил и т.д.). У пациентов не было выраженных изменений функциональных проб печени: отмечены повышение аланинаминотрансферазы [АЛТ, в среднем в 2 раза) и у-глутаминтранспептидазы [у-ГТП, в 2-4 раза) и снижение протромбинового индекса [до 70%). При ультразвуковом исследовании печени обнаружены повышение эхогенности и диффузная неоднородность ее паренхимы. Перед началом лечения всем больным была проведена пункционная биопсия печени.

Получение стволовых клеток

Стимуляцию выхода в периферическую кровь предшественников гемопоэза проводили с помощью «Нейпогена» в дозе 480 мг подкожно в течение 4-5 дней. На пятый день стимуляции, когда наблюдался выраженный лейкоцитоз и пик числа моноцитов в периферической крови, проводили выделение фракции мононуклеаров на клеточном сортере MSC+ согласно протоколу изготовителя [Haemonetics, USA). Анализ выделенных клеток показал, что количество ядросодержащих мононуклеаров составило 1,7х106 [1-й больной), 1,4х106 [2-й больной), 2,0х106 [3-й больной) в 1 мл. Двадцать мл клеточного концентрата были введены в чревный ствол в течение трёх часов после выделения. Введение клеток в чревный ствол прошло без осложнений. Уже на следующий день пациенты вели обычный образ жизни.

Результаты и обсуждение

Наблюдение за больными в течение 4-х недель после введения стволовых клеток показало улучшение общего самочувствия, повышение работоспособности, исчезновение слабости и дискомфорта в правом подреберье. Через месяц после введения стволовых клеток у всех больных снизились показатели цитолиза, повысился протромбиновый индекс, произошло снижение у-ГТП [в одном случае до нормы) [табл. 1).

Согласно протоколу, всем больным была проведена пунк-ционная биопсия печени до трансплантации стволовых клеток и через месяц после трансплантации. Сравнительный анализ индекса гистологической активности [ИГА) представлен в табл. 2.

Через месяц после трансплантации у всех больных произошло снижение ИГА на 2-3 балла. За счет чего произошло это снижение? В первую очередь, за счет уменьшения внутридольковых некрозов и дегенераций паренхимы и портального воспаления. К сожалению, выраженность некрозов вокруг портальных трактов не изменилась, и в био-птатах отмечены порто-портальные мостовидные некрозы. Эти некрозы всегда были локализованы в области портопортальных соединительнотканных септ, за счет которых у больных был диагностирован тяжелый фиброз [3 балла).

Очевидно, что один месяц — недостаточный срок для разрешения фиброза. В то же время снижение ИГА за счет уменьшения внутридольковых дегенераций и портального воспаления отражает позитивные изменения в состоянии печени после трансплантации. Более того, благоприятные морфологические изменения в паренхиме печени объясняют и положительную динамику биохимических показателей.

Наиболее выраженным морфологическим изменением, которое мы обнаружили, было исчезновение соединительной ткани из пространства Диссе. До трансплантации у всех больных был выявлен перисинусоидальный фиброз, а через месяц после трансплантации стволовых клеток мы не обнаружили отложения коллагеновых волокон между эндотелием и гепатоцитами [рис. 4).
Согласно протоколу, биоптаты окрашивали антителами против PCNA, а-ГМА и CD34. Данные иммуногистохими-ческого исследования представлены в таблице 3. Два факта обращают на себя внимание — резкое снижение пролиферативной активности гепатоцитов и исчезновение CD34 в мембранах эндотелия синусоидов после трансплантации.

Высокая пролиферативная активность в гепатоцитах до трансплантации [рис. 5А) указывает на напряженность регенераторного ответа. Такого рода напряженность всегда наблюдается при повреждении гепатоцитов и является ответной реакцией на уменьшение клеточной массы или повреждение гепатоцитов. Через месяц после трансплантации число пролиферирующих гепатоцитов было в пределах 1-5%, что является показателем, близким к норме [рис. 5Б).

Интересные изменения произошли после трансплантации стволовых клеток с эндотелием синусоидов. У всех больных до трансплантации была выражена капилляризация си-нусоидов — эндотелиальные клетки экспрессировали CD34 [рис. 6А). Такого рода изменения фенотипа эндотелия в синусоидах печени указывают на то, что фенестрированный эндотелий стал менее проницаемым. Через месяц после трансплантации ситуация кардинально изменилась — в синусоидах обнаруживали лишь единичные CD34+ эндотелиальные клетки [рис. 6Б).

Определенные изменения наблюдались и в экспрессии а-ГМА. До трансплантации у всех больных внутри соединительнотканных септ присутствовали миофибробласты [рис. 7А), что указывало на продолжающийся синтез компонентов соединительной ткани и прогрессирование фиброза. У одного больного миофибробласты были обнаружены и в синусоидах, что является неблагоприятным прогностическим
фактором в плане дальнейшего фиброзирования паренхимы печени. После трансплантации количество миофибробластов заметно уменьшилось, и немногочисленные а-ГМА+ клетки обнаруживали только в пределах уже сформированных соединительнотканных септ, в основном же а-ГМА присутствовал в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов [рис. 7Б).

Поскольку именно миофибробласты являются основным источником соединительной ткани в регенерирующей печени, уменьшение их числа объясняет как восстановление нормальной структуры синусоидных капилляров, так и исчезновение перисинусоидального фиброза.

Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток в чревный ствол больным хроническим гепатитом в стадии тяжелого фиброза является безопасной процедурой. Через месяц после трансплантации аутогенных гемопоэтических стволовых клеток улучшаются общее состояние больного и показатели функциональных проб печени, происходят положительные изменения в морфологии печени [снижается индекс гистологической активности за
счет уменьшения выраженности портального воспаления и внутридольковых некрозов). Однако самым важным результатом трансплантации гемопоэтических стволовых клеток является то, что в печени происходят качественные структурные изменения — значительно снижается пролиферация гепатоцитов, уменьшается число миофибробластов в паренхиме, что приводит к разрешению перисинусоидального фиброза и восстановлению нормального строения синусоидных капилляров. Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности данного метода лечения для подавления прогрессирования гепатита и фиброзирования печени и о высокой информативности иммуногистохимических методов в оценке эффективности трансплантации.