Ифа в диагностике гепатита с
Вирусом гепатита С заражено около 170 миллионов человек по всему миру. Болезнь коварная – при смазанной симптоматике начала заболевания ее дебют проходит незамеченным. Часто развиваются хронические формы, которые приводят к разрушению клеток печени.
Исходом гепатита С становятся цирроз или рак печени. Для выявления маркеров заболевания в первую очередь назначают иммуноферментный анализ – ИФА на гепатит С.
Что такое ИФА?
Анализ основан на способности специфических антител (белков крови) связываться с антигеном (частицами вируса), при этом один из них «помечен» ферментом. Образовавшийся комплекс реагирует с подкрашенным субстратом, что фиксируется спектрофотометрическими методами.
Иммуноферментный анализ (ИФА) на гепатит С показывает не присутствие самого вируса-возбудителя в крови, а ответ иммунной системы на столкновение с ним. Количество вируса в крови на момент проведения ИФА может быть ничтожно мало, за порогом определения. А антитела – иммуноглобулины, которые выработались при встрече с «агрессором», продолжают циркулировать в кровеносной системе.
Именно присутствие антител определяется при ИФА. Появляются они в срок от нескольких дней до нескольких недель после заражения гепатитом С.
ИФА выявляет циркулирующие иммуноглобулины даже в малой концентрации. По их типу можно судить о давности заболевания. В острый период, когда вирус гепатита активно размножается, определяют иммуноглобулины класса М.
В хронической стадии (спустя 6 мес. от начала заболевания) при ИФА обнаруживают иммуноглобулины класса G. Последний тип также может свидетельствовать не о хронизации процесса, а о самом факте столкновения иммунной системы с вирусом гепатита С в прошлом.
Показания к ИФА на гепатит С
Обследование на маркеры гепатита С, к которым относятся антитела – иммуноглобулины, давно стала рутинной процедурой. ИФА назначают при:
- острых и хронических заболеваниях печени;
- желтухе неясного генеза;
- обследовании перед хирургическими вмешательствами;
- стандартном обследовании доноров крови;
- постановке на учет в женской консультации при беременности. Повторно анализ сдают за 2-4 недели до предполагаемой даты родов;
- прохождении гемодиализа;
- профилактических осмотрах медработникам, контактирующим с компонентами крови и другими биологическими жидкостями;
- незащищенном сомнительном половом контакте;
- рождении детей от инфицированных матерей.
В порядке рекомендаций анализ на гепатит С назначают родственникам больного, близко с ним контактирующим. В 50% случаев парентеральный источник заражения выявить не удается. Инфекционисты предполагают бытовой путь передачи, когда зараженная кровь может попадать в кровоток здорового человека через кожные ранки и трещины. У этой версии много противников.
Как проводится анализ?
За 48 часов до ИФА исключают из пищи алкоголь, жареное, жирное и соленое. За 12 часов до забора крови из вены пациенту необходимо воздержаться от приема каких-либо лекарств. Анализ сдают утром натощак.
Наибольшее распространение получил «твердофазный» ИФА. Твердая фаза – это материал, на котором фиксируют антитела или антигены. В этом качестве используют мембраны, активно собирающие на себя белки (лабораторные планшеты, стенки пробирки, шарики и бусины из полипропилена или поливинилхлорида, нитроцеллюлозу и пр.).
Вне зависимости от разновидности ИФА, в его проведении существует строгая этапность:
- На первой стадии исследуемый материал «узнается» специфическим антителом и связывается с ним, образуя иммунный комплекс;
- На второй стадии с образовавшимся иммунным комплексом реагирует помеченный ферментом так называемый конъюгат – антитело или антиген;
- Заключительная стадия ИФА позволяет уловить и зарегистрировать сигнал от ферментной метки.
Виды ИФА
Вариантов выполнения анализа достаточно много. Их классифицируют:
- По типу реагентов, используемых на первом этапе ИФА:
a) конкурентный;
b) неконкурентный;
- По степени однородности среды, в которой происходят реакции ИФА:
a) гомогенные;
b) гетерогенные;
- 3) По принципу определения исследуемого вещества:
a) прямой;
b) непрямой. Именно непрямой метод ИФА используется при выявлении маркеров гепатита С.
Прямой метод ИФА
При этом методе используют стандартные антитела к вирусу гепатита С, помеченные меткой – ферментом.
- В лунки лабораторного планшета (если выбрали именно его в качестве твердой фазы) помещают сыворотку крови пациента. Выдерживают 20 минут, чтобы антигены (белки вируса гепатита С) успели прикрепиться к стенкам.
- Добавляют стандартные помеченные ферментом антитела к гепатиту С. Выдерживают еще несколько часов – за это время образуются иммунные комплексы антиген-антитело с меткой. Чем больше антигенов в исследуемой сыворотке, тем больше таких комплексов образуется.
- Содержимое лунок промывается от несвязанных белков. Затем добавляют субстрат. Это вещество при реакции с ферментом-меткой меняет цвет. Чем больше комплексов при ИФА образовалось, тем большее количество фермента может воздействовать на субстрат и тем ярче хроматографическая реакция. Она считывается ИФА-ридером и оценивается количественно.
Непрямой метод
При этом методе ИФА стандартный антиген связывается с антителами сыворотки пациента. К образовавшемуся иммунному комплексу добавляют меченые ферментом стандартные антитела к иммуноглобулинам.
- В лунки лабораторного планшета помещают стандартный антиген гепатита С (частички вируса). Антиген прикрепляется к стенке, незакрепленные белки вымываются лаборантом.
- В подготовленные таким образом лунки помещают исследуемый материал (сыворотку крови), инкубируют. Есть обязательные контрольные лунки со стандартными реагентами. За время инкубации образуются комплексы антиген-антитело. Непрореагировавшие компоненты опять вымывают.
- В лунки добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам М и G. Эти белки прореагируют с образовавшимся ранее комплексом, только если в исследуемом образце есть антитела к гепатиту С. Промывают.
- Добавляют еще один компонент – субстрат. Это химическое соединение разрушается ферментом из комплекса антиген-антитело. При этом образуется окрашенное вещество, количество которого фиксируют специальным прибором – ИФА-ридером. Чем больше фермента, тем сильнее он прореагирует с субстратом и тем ярче будет цветовой сигнал.
Расшифровка результатов
Высокая чувствительность ИФА иногда играет с пациентом злую шутку. Не каждый положительный результат означает заболевание и не каждый отрицательный – гарантия свободы от вируса.
При положительном ИФА определяют генотип вируса и определяют количество циркулирующих в крови вирусов с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Положительный
При ИФА выявляют маркеры острой фазы заболевания (иммуноглобулины класса М (IgM)) и иммуноглобулины класса G (IgG). Последние могут означать, что у пациента хронический гепатит С или то, что иммунная система хотя бы раз в прошлом сталкивалась с этим вирусом и выработался иммунитет.
Выявление одновременно двух типов иммуноглобулинов при ИФА говорит об обострении хронического гепатита С.
Отрицательный
Самый вероятный вариант – пациент не болен и его иммунная система никогда не сталкивалась с вирусом.
Псевдоотрицательный результат при ИФА можно получить в том случае, если пациент инфицировался относительно недавно и защитные антитела просто не успели выработаться. Это так называемое «диагностическое окно». Его срок – 6 месяцев.
Наконец, нельзя полностью исключить ошибку лаборатории.
Ложноположительный
ИФА реже дает погрешности по сравнению с ПЦР. Тем не менее, исследуемые вещества – белки. Реагент может связаться с неспецифическим белком сыворотки крови. Ложноположительный ИФА на гепатит С нередок в случаях:
- выполненной накануне вакцинации;
- при аутоиммунных патологиях или туберкулезе, рассеянном склерозе, склеродермии;
- опухолевом процессе;
- инфекциях, протекающих с гипертермией (грипп, ОРЗ и пр.).
Грешат ложноположительными результатами исследования на маркеры гепатита С у беременных. Довольно часто ИФА дает ложное заключение о наличии антител пациентам со II группой крови.
ИФА положительный, а ПЦР отрицательный: что это значит?
Полимеразная цепная реакция выявляет присутствие вируса в крови и его количество, помогает определить генотип. ИФА «видит» антитела – клетки, вырабатываемые спустя какое-то время после инфицирования и остающиеся в организме после уничтожения «врага».
Вариантов, при которых у пациентов с гепатитом С ПЦР отрицательный, а ИФА – положительный, два. Самый вероятный – сформировался иммунитет к вирусу, а сам он уничтожен иммунной системой или лекарствами.
Второй: нельзя исключить ошибку лаборатории при проведении ПЦР.
Диагностикой заболеваний должен заниматься врач. Он учитывает все нюансы обследования. А лабораторная диагностика, в том числе ИФА – только вспомогательный метод, не лишенный погрешностей.
Источник
Констатация HCV-инфекции базируется на выявлении специфических серологических маркеров. Это важно не только для дифференциальной диагностики гепатита С, но и для суждения о стадии заболевания, прогнозировании его течения, оценки активности процесса и эффективности противовирусной терапии.
Наиболее широко практикуется определение антиHCV антител. Принципиальное значение имеет генодиагностика, основанная на детекции РНК HCV. Недавно появилась возможность обнаружения циркулирующих HCV антигенов.
Метод ИФА
Выявление антиHCV антител проводят при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на основе комплекса структурных и неструктурных вирусных пептидов. В настоящее время применяются диагностические системы 3го поколения, которые построены из рекомбинантных и/или синтетических фрагментов структурных и неструктурных HCVбелков (С, NS3, NS4 и NS5). Внедрение диагностикумов 3-го поколения позволило сократить сроки первичного выявления антиHCV при острой инфекции, существенно повысить чувствительность и специфичность реакции (рис 1).
Рис.1 Детекция маркеров HCV тестами разных поколений
Частота выявления анти-HCV среди РНК HCV позитивных образцов крови приближается к 100 %. На фоне хронической инфекции антитела выявляются постоянно, а после элиминации вируса сохраняются (прежде всего, анти-С) в течение 48 и более лет. Поэтому формальное наличие анти HCV не всегда говорит о присутствии вируса в организме и не позволяет судить об активности процесса. Для суждения о вирусной нагрузке, активности HCV репликации, риска хронизации, разграничения острого и хронического гепатита, длительности инфекционного процесса и степени поражения печени предложено использовать определение спектра антител к различным HCV пептидам, а также наблюдать за их качественной и количественной динамикой. Это дает ориентировочную информацию, которая требует подтверждения другими методами.
Детекция антител к каждому из HCV антигенов имеет самостоятельное диагностическое значение. Так например известно, что анти core, анти Е и анти NS3 выявляются на самых ранних этапах сероконверсии, анти NS4 и анти NS5, как правило, появляются позднее. По мере развития инфекционного процесса титры выявляемых анти HCV увеличиваются.
Было показано, что наличие в сыворотке анти HCV core является достаточно надежным маркером вирусной репликации, поскольку имеются данные о том, что их присутствие коррелирует с наличием в сыворотке специфической м РНК.
Анти НCV core тест может использоваться в качестве подтверждающего теста при тестировании образцов с «неопределенными» результатами. Сыворотки крови, в которых анти НCV core детектируется в разведении 1:1000 с большой вероятностью содержат вирус и являются реально позитивными. Образцы, являющиеся позитивными в разведении 1:200 и отрицательными в разведении 1:1000, необходимо в дальнейшем исследовать на наличие вирусной РНК. С большой вероятность эти сыворотки можно отнести к реально негативным. Таким образом, используя предварительный анти HCV core тест можно существенно снизить количество образцов, требующих подтверждения методом ПЦР.
Анти NS3 могут являться самостоятельным диагностическим маркёром острой НCV инфекции. Высокие титры анти NS3 при остром гепатите С свидетельствуют о значительной вирусной нагрузке, а длительное сохранение их в острой фазе связано с высоким риском хронизации инфекционного процесса.
Выявление анти NS4 и высокие титры этих антител чаще всего свидетельствуют о длительности инфекционного процесса, и, по всей видимости, коррелируют со степенью поражения печени.
Имеются данные, говорящие о том, что выявление антитNS5 в высоких титрах часто свидетельствует о присутствии вирусной РНК, а в острой стадии является предиктором хронизации инфекционного процесса. Также имеются данные о том, что в NS5 области вируса гепатита С имеются последовательности, неспецифически реагирующие с антителами в сыворотках крови человека. При помощи синтетических пептидов было проведено эпитопное картирование этой области, и были найдены последовательности, специфически реагирующие с антителами, вырабатываемыми именно к вирусу гепатита С.
Большое значение для клинической практики может иметь выявление анти Е1/Е2. Выявление анти Е в течение 1 месяца от начала заболевания и быстрое последующее снижение может свидетельствовать об очищении организма от вирусной РНК, определение анти Е при хроническом гепатите С свидетельствует об активной вирусной репликации.
Для многих вирусных заболеваний, таких как гепатит В, гепатит Д, гепатит А, определение антител класса IgM к различным вирусным маркерам является важным диагностическим показателем острой или хронической инфекции. Важность определения антител этого класса при инфекции вируса гепатита С остается не вполне ясной. Разными авторами получены противоречащие друг другу результаты. Вопреки ожиданиям IgM ответ в острой фазе гепатита С не следует классическому пути антителообразования: IgM анти HCV могут выявляться одновременно и даже позднее, чем анти HCV класса IgG. Поэтому обнаружение IgM анти HCV не может быть использовано как маркер острой HCV инфекции. Вместе с тем длительность циркуляции антикор IgM (35 месяцев) является фактором, прогнозирующим персистентную инфекцию, а их появление при хроническом гепатите С свидетельствует о реактивации вируса, т.е. об обострении процесса. Этому соответствует корреляция между темпами снижения антикор IgM и эффективностью противовирусной терапии.
Иммунблотинг
Иммунблотинг (англ. «blot» пятно) основан на дифференцированном определении антител к различным антигенам (С, NS3, NS4 и NS5), которые в виде дискретных фракций («пятен») фиксируются на нитроцеллюлозных полосках и после инкубации с исследуемой сывороткой проявляются мечеными антителами так же, как в «обычном» ИФА. Результат считается положительным при выявлении антител к двум и более антигенам.
Несмотря на высокую специфичность, современные ИФА-системы не гарантированы от гипердиагностики, т.е. от ложноположительных результатов. Для их исключения также требуется динамическая оценка на основе индикации анти HCV к дискретным антигенам (подтверждающие, или конфирмативные тесты).
Наряду с ложноположительными возможны и ложноотрицательные результаты, когда анти HCV антитела не удается обнаружить несмотря на присутствие вируса в организме. Известны по меньшей мере три подобных ситуации:
1) начальный период заболевания (серонегативная фаза острого гепатита фаза «окна»),
2) больные, получающие иммунодепрессанты (они могут быть длительно инфицированы без сероконверсии),
3) заражение некоторыми HCV генотипами (прежде всего 3 и 4).
В настоящее время коммерческие тесты для выявления антител к вирусу гепатита С используют в качестве антигенов рекомбинантные белки или синтетические пептиды, созданные на основе аминокислотной последовательности вируса гепатита C 1-го генотипа. Однако, растет число наблюдений, что такие тесты могут быть недостаточно эффективны для надежной детекции антител при инфицировании вирусом другого генотипа. Так, например, было показано, что антигены, полученные из NS3 области HCV 1-го генотипа, в 5 раз более эффективно узнают антитела в сыворотках больных, инфицированных вирусом HCV 1го генотипа, чем в сыворотках больных, инфицированных вирусом 2го или 3го генотипа. Исследования, проведенные L Bassit (2002) продемонстрировали неспособность нескольких коммерческих тестов адекватно детектировать антитела к вирусу гепатита С у больных, инфицированных вирусом 1а и 3а типов. Это наблюдение имеет огромное значение как для регионов, где превалируют вирусы других типов, так и для отдельных популяций.
Таким образом, для эффективной диагностики гепатита С необходим высокочувствительный тест, способный адекватно реагировать с анти-ВГС любого генотипа.
Кроме прямого изучения структуры РНК, информация о зараженности конкретным генотипом может быть получена на основе изучения антител против генотипоспецифических эпитопов, локализованных в NS5, NS4 и С белках вируса. Перечень серотипируемых вариантов HCV в настоящее время включает генотипы (субтипы) 1a, 1b, 2a, 2b, 3a и 4а. Результаты серотипирования и РНК-типирования совпадают в 50-95% случаев, в зависимости от генотипа. Осуществляется коммерческий выпуск диагностических препаратов для серотипирования в планшетном варианте ИФА и иммуноблоте.
Источник
Для диагностики вирусного гепатита в рамках медицинского протокола используется несколько лабораторных и инструментальных методик. Одной из самых достоверных является иммуноферментный анализ (ИФА). Метод помогает определить наличие антигена к тому или иному виду вируса. Для этого выполняется стандартная процедура забора крови из вены пациента. Результаты становятся известны уже через неделю после взятия анализа.
Что такое ИФА?
Термин расшифровывается как «иммуноферментный анализ». Он подразумевает определение в крови комплексов антиген-антитело для уточнения этиологии возбудителя. Если это вирус, определяются его виды и подвиды. Антигены — это частички на поверхности клеток возбудителей, связывающиеся с определенными участками антител. Последние являются иммунными молекулами, вырабатываемыми организмом для собственной защиты. Антигены и антитела неповторимы, поэтому определение их структуры с помощью иммуноферментного анализа свидетельствует о наличии конкретной патологии в организме больного. В качестве меток используются ферменты, которые и дали название методике.
Вернуться к оглавлению
Плюсы исследования
ИФА — это высокоточная методика, ее чувствительность достигает 90%. Она помогает проводить скрининг парентеральных гепатитов. Эти заболевания передаются путем инъекции, или через переливание крови. ИФА помогает выявить пациентов, у которых отсутствуют симптомы. Таковыми является большинство хронических больных. Они имеют риск развития цирроза. Его обнаружение на поздних стадиях — это плохой прогноз. Поэтому иммуноферментная методика позволяет своевременно определить заболевание и сэкономить деньги на лечение. ИФА верифицирует этиологию возбудителя и определяет прогноз недуга. Диагностические наборы для нее стоят недорого и длительно хранятся. За быстроту, удобство и точность данных ИФА называют экспресс-методом.
Вернуться к оглавлению
Когда нужен анализ?
Для определения вида вируса необходимо сдать ИФА.
ИФА необходим, когда требуется уточнить этиологию вирусного возбудителя для определения схемы лечения. У пациента идентифицируют наличие хронического гепатита B и C, или перенесенного заболевания вирусом подтипа A. Методику нужно применять у членов семьи больного, которые могут заразиться. В инфекционном стационаре анализ выполняется всем пациентам, у которых присутствуют такие симптомы:
- Желтуха. Желтушность кожных покровов не сопровождается болями в правом подреберье и изменением цвета стула и мочи.
- Повышение температуры тела. Она вырастает до субфебрильных цифр, иногда наступает лихорадка.
- Диспепсия. Присутствуют тошнота и рвота, которая не приносит облегчение.
- Немотивированная слабость.
- Мелкоточечные высыпания на теле. Это мелкие кровоизлияния вследствие печеночной недостаточности.
- Тяжесть в правом подреберье. Симптом возникает вследствие растяжения увеличенной печенью собственной капсулы, содержащей множество нервных окончаний.
Основным показанием к выполнению анализа является наличие определенных анамнестических данных. Если пациент ранее страдал инъекционной наркоманией, ему переливали кровь или пересаживали органы — это повод выполнить ИФА.
Вернуться к оглавлению
Подготовка к проведению
Чтобы результаты ИФА были достоверными, требуется предварительно подготовиться. За день до сдачи крови пациенту рекомендуется перестать употреблять жирную и жареную пищу, продукты с высокой концентрацией красителей, стабилизаторов, консервантов, усилителей вкуса и аромата. Нежелательно непосредственно перед выполнением метода заниматься тяжелым физическим трудом и спортивными упражнениями. В день сдачи крови необходимо воздержаться от завтрака. Забор материала натощак позволит получить точный результат. Необходимо исключить из употребления некоторые лекарственные средства. Но самостоятельно это делать не рекомендуется, поскольку есть вероятность вреда для здоровья. Нужна предварительная консультация лечащего доктора.
Вернуться к оглавлению
Методология проведения
Метод ИФА.
Метод ИФА состоит из двух этапов. На первом выполняется забор материала, на втором последний исследуется в лаборатории. Начальный этап проходит стандартно. Ему предшествует подготовка пациента к сдаче крови. В стерильном помещении проводится забор биоматериала, отправляемый в герметических контейнерах на лабораторное исследование. Дальнейшее определение комплексов антиген-антитело происходит с помощью ферментов и тест-систем на специализированном оборудовании. Результат становится известен в течение недели и отправляется пациенту на электронную почту.
Вернуться к оглавлению
Расшифровка показателей
Интерпретация данных подразделяется на качественную и количественную. При качественном определении результаты анализа считаются позитивными, если обнаружены суммарные антитела к определенному подтипу вируса. Выявление anti-НАV IgМ свидетельствует про острый, а anti-НАV IgG — хронический гепатит А. Позитивный маркер НВsAg — признак инфицирования вирусом подтипа В. Он наблюдается в острой и хронической фазах заболевания. Если же выявлен HBCAg, у человека присутствует хронический гепатит С. А anti-НDV сигнализирует про инфицирование подвидом D. Пациенты, у которых определен положительный маркер к вирусу, нуждаются в дальнейшем обследовании для более точной верификации диагноза.
Источник
