Ифа в диагностике вирусных гепатитов

Иммуноферментный анализ – это метод диагностики вирусных заболеваний. ИФА на гепатит С показывает реакцию иммунной системы на действие патогенных микроорганизмов. Для процедуры используют венозную кровь и ищут в ней антитела к вирусу гепатита. Иммуноферментный анализ недорогой, выполняется быстро, но требует подтверждения повторным ИФА или более дорогим ПЦР.

Сущность и достоверность метода

Метод основан на способности антител (клеток иммунной системы) образовывать комплексы с частицами вируса гепатита (антигенами). Для определения этих комплексов пользуются специальными маркерными ферментами. Анализ дает возможность выявить количество антител к вирусу в первые 6-12 недель болезни.

Подготовка к ИФА включает:

• исключение физических нагрузок за сутки до исследования;
• запрет на употребление алкогольных напитков, табачных изделий и жирной пищи;
• временное прекращение приема лекарственных препаратов и оральных контрацептивов.

Кровь для иммуноферментного анализа на гепатит берут утром натощак. Достоверность данного метода повышается при повторном проведении ИФА спустя 2 недели после процедуры.

Результат анализа показывает:

1. уровень эффективности работы иммунной системы при борьбе с вирусом;
2. стадию заболевания;
3. течение – острый или хронический гепатит.

Женщинам в период беременности необходимо сдать кровь на ИФА минимум два раза:

• на ранних сроках (4-5 недель);
• перед родами;

Преимущества ИФА заключаются в:

• доступной стоимости анализа для всего населения;

• полной автоматизации процесса, исключающей ошибку человека;

• быстром получении результата анализа;

• возможности выявить инфекционное заболевание на ранних этапах;

• высокой точности.

Показания к ИФА на гепатит С

Гепатит С – опасное вирусное заболевание, которое передается через кровь и разрушает клетки печени.

Показания к анализу крови на ВГС:

• наличие ВИЧ-инфекции;
• симптомы острого гепатита: рвота, вялость, чувство горечи во рту, отсутствие аппетита, желтушный цвет кожных покровов и др.;
• хронический гепатит;
• наличие в биохимическом анализе крови повышенного билирубина и изменение коэффициента де Ритиса (указывают на нарушения работы печени);
• принадлежность к группе риска (врачи, медсестры, наркозависимые);
• наркотическая и алкогольная зависимость.

Проверку на гепатит С обязаны проходить военные, сотрудники правоохранительных органов, работники общепита и социальных служб.

Какие антитела обнаруживает тест

Анализ на гепатит С, проведенный методом ИФА, способен обнаружить антитела двух типов:

1. IgM;
2. IgG.

IgM – иммуноглобулин, имеющий самую крупную молекулярную массу и неспособный проникать через плацентарный барьер. Антитела класса IgM вырабатываются в организме первыми – спустя 6 недель после заражения. Через полгода уровень иммуноглобулинов типа М снижается и остается таким до следующего рецидива болезни (при хроническом гепатите). Иммуноглобулины M являются основой первичного иммунного ответа зараженного организма.

IgG – основной иммуноглобулин сыворотки крови, является вторичным иммунным ответом. Обеспечивает иммунитет ребенка, рожденного от инфицированной матери. Иммуноглобулины G вырабатываются спустя 3 месяца после возникновения заболевания, достигают максимальной концентрации на пятом месяце и остаются в этом количестве на протяжении многих лет.

В периоде острого вирусного гепатита есть две стадии. На первой происходит активация и выделение IgM, на второй – IgG. В острой фазе болезни IgM и IgG образуются к нуклеокапсидному белку вируса Core. При латентном (скрытом) течении вырабатываются IgG к белку core и неструктурному белку NS.

Способы проведения

Диагностика гепатита включает два способа проведения ИФА – прямой и непрямой.

Прямой

Прямой метод ИФА на антитела к гепатиту С основан на образовании комплексов антиген-антитело.

Стадии проведения:

1. В специальную таблицу с лунками заносят биологический материал пациента (кровь) и оставляют на 30 минут. Важные элементы приклеиваются ко дну лунок. 
2. Добавляют специальные меченые антитела. Они прикрепляются к антителам исследуемой крови (если такие есть). Здесь выжидают несколько часов. 
3. Содержимое лунок сливают и промывают от лишних веществ.
4. В каждую лунку добавляют ферменты, которые распознают добавленные ранее антитела. Ферменты связаны со специальным маркером.
5. При положительной реакции маркерное вещество становится окрашенным.

Эта методика включает несколько простых шагов и обеспечивает достоверный результат.

Непрямой

Непрямой метод ИФА отличается тем, что в системе участвуют не два, а три компонента.

Он включает два варианта:

• Конкурирующий: в исследуемую систему добавляют антигены, кровь пациента, в которой предполагается наличие иммуноглобулинов, и антитела, помеченные ферментом. Две группы антител вступают в борьбу за образование комплексов с антигеном. Положительной реакция считается при максимальном количестве антител первой группы и минимальном – второй группы.
• Сэндвич-ИФА: в лунки заносят антитела к исследуемому антигену, после чего добавляют кровь и новые антитела. Исследуемый антиген оказывается между двумя молекулами иммуноглобулинов. Этот «сэндвич» виден визуально или при подсвечивании специальным спектром.

Расшифровка анализа

Существует четыре варианта расшифровки анализа:

1. Положительный результат. В исследуемом материале обнаружены IgM и IgG к вирусу гепатита – означает, что человек заражен давно (более 3 месяцев назад). Если обнаружены только IgM, то инфекция попала в кровь месяц назад, если только IgG – произошло выздоровление или хронизация гепатита.
2. Отрицательный результат. Иммуноглобулинов в исследуемой крови не обнаружено. Человек полностью здоров.
3. Ложноположительный результат. ИФА всегда нужно проверять полимеразной цепной реакцией (выявляет сам вирус в крови или печеночной ткани). Если ПЦР дает отрицательный результат, то ИФА следует провести заново.
4. Сомнительный результат. Если прошло очень мало времени после рискованной ситуации, ИФА может не выявить наличия антител. Для подтверждения результата необходимо провести повторный анализ через две недели.

Ложноположительный и ложноотрицательный результаты ИФА могут возникнуть вследствие ошибки в лаборатории или неправильной подготовке к анализу. У беременных ложные результаты встречаются чаще, чем у остальных людей.

Почему ИФА положительный, а ПЦР отрицательная

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – дополнительный метод диагностики вирусных заболеваний. Выявляет РНК вируса, то есть его генетическую информацию, применяется для подтверждения диагноза. В некоторых случаях ПЦР дает отрицательный результат при положительном показателе ИФА.

Почему так происходит:

• Выздоровление: ПЦР реагирует только на РНК вируса гепатита, а ИФА может дать положительный результат и после выздоровления, ведь он выявляет клетки иммунной системы, которые сохраняются в крови на несколько лет.
• Разный исследуемый материал: при заборе из разной локализации может возникнуть несоответствие результатов. Так, для ПЦР берут не только кровь, но и кусочек ткани печени.
• Разные тестовые системы. 

Что покажет ИФА после лечения гепатита

После пройденной терапии против гепатита С необходимо еще раз сдать кровь на ИФА.

Иммуноглобулины G сохраняются в организме несколько лет после выздоровления, поэтому повторный анализ на гепатит может быть положительным. В этом случае необходимо дополнительно сдать кровь на ПЦР. Отрицательный результат ПЦР на гепатит будет свидетельством того, что человек здоров, а положительный – подтвердит ИФА и укажет на некачественное лечение.

Отрицательный результат повторного ИФА является подтверждением выздоровления.

ИФА относится к лабораторным методам высокой точности и позволяет выявить заболевание на ранних сроках. При первых симптомах гепатита нужно срочно обратиться к врачу, который назначит необходимые анализы для подтверждения диагноза.

Если у вас так же обнаружен РНК гепатита С в крови (вирусная нагрузка), рекомендуем ознакомиться с материалом по расшифровке анализов при гепатите С.

ИФА в диагностике вирусных гепатитов. Возможности иммуноферментного анализа

Специфическая лабораторная диагностика вирусных гепатитов основывается на применении иммунохимических и молекулярно-биологических методов исследований. Основными иммунохимическими методами являются радиоизотопный или радиоиммунный (РИА) и иммуноферментный (ИФА). В основе иммунохимических методов диагностики лежит специфическое взаимодействие антиген — антитело с последующим выявлением комплекса при помощи специальных меток. Наиболее распространенным является иммуноферментный анализ.

Первые сообщения о применении иммуноферментного анализа, как метода для определения каких-либо веществ были опубликованы в 1971 году одновременно двумя исследовательскими группами — В. Van Weemen, A. Schuurs и Е. Engvall, P. Perlmann. В основе иммуноферментного анализа лежит следующий принцип: на твердой фазе, в качестве которой используется, главным образом, поверхность лунок полистиролового планшета, фиксируется антиген возбудителя инфекции или антитела (часто смесь антител) к антигенам, которые необходимо обнаружить. Этот антиген или антитела, которые зафиксированы на твердой фазе, называются иммуносорбентом.

В результате инкубации иммуносорбента и испытуемой сыворотки при наличии определяемого агента происходит их связывание в комплекс антиген — антитело. После процедуры промывки, в ходе которой удаляются несвязанные антигены и антитела, проводится инкубация с конъюгатом. В качестве конъюгата при детекции HBsAg используют анти-HBs, при детекции антител к вирусу гепатита С —антитела к иммуноглобулинам человека (антивидовой конъюгат), меченные пероксидазой хрена. В итоге этой инкубации происходит присоединение к уже имеющимся комплексам антиген — антитело дополнительно внесенного конъюгата. После удаления несвязавшегося конъюгата (отмывки) в лунки вносится субстрат. При использовании пероксидазного конъюгата в качестве субстрата используют перекись водорода в сочетании с индикатором, в качестве которого наиболее часто применяют ортофенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ). Результат оценивается фотометрически.

Качество и надежность аналитических возможностей иммуноферментного метода характеризуются рядом критериев, к числу которых относятся чувствительность, специфичность, правильность и воспроизводимость.

Чувствительность — то минимальное количество вещества, которое может быть обнаружено при помощи иммуноферментного анализа. При этом нижним пределом чувствительности данного метода является концентрация исследуемого вещества в образце, которая соответствует наименьшему положительному результату определения, статистически достоверно отличающемуся от показателей заведомо отрицательных образцов. Чувствительность ИФТС зависит от ряда обстоятельств, связанных как с конструкцией тест-системы (аффинность иммуносорбента, качества экстракционных и буферных систем), так и разрешающей способностью и точностью метода регистрации.

Специфичность — способность выявлять именно те компоненты, для определения которых предназначена данная иммуноферментная тест-система. Специфичность ИФА определяется во многом перекрестной реакцией антител или антигенов (то есть композиции, используемой в качестве иммуносорбента), с близкородственными соединениями, а также составом инкубационной среды (матрикс-эффект).

Правильность — соответствие среднего значения результатов повторных определений одного и того же контрольного образца с истинной величиной измеряемого параметра. Правильность определения в ИФА зависит от качества самой тест-системы и контрольного образца. Для хороших иммуноферментных тест-систем показатели правильности лежат в пределах 90-110 %. Особенностью медико-биологических исследований в ИФА является невозможность установления точной величины, и поэтому за истинную величину принимается средняя от нескольких экспертных лабораторий. Статистическим критерием правильности служит средняя арифметическая и степень ее отклонения от истинного значения, выраженная в процентах.

Воспроизводимость — способность тест-системы показывать одни и те же значения при повторных исследованиях одного и того же образца. Воспроизводимость зависит как от случайных погрешностей (ошибок) при проведении процедуры постановки реакции, так и от качества тест-систем и точности метода регистрации результатов. Считается, что воспроизводимость одних и тех же контрольных образцов одной фирмы в разных лабораториях не должна превышать величину коэффициента вариации в 15%.

Существует несколько специфических схем ИФА для определения маркеров вирусных гепатитов: а) прямой иммуноферментный анализ; б) непрямой иммуноферментный анализ; в) конкурентное ингибирование; в) «ловушеч-ный», или «capture» метод.

Из молекулярно-биологических методов диагностики вирусных гепатитов чаще используются полимеразная цепная реакция и гибридизация. Эти методы, особенно ПЦР, позволяют выявлять очень малые количества специфической вирусной ДНК или РНК и, таким образом, судить о репликации, а в ряде случаев и об активности репликации.

Видео лабораторная диагностика вирусных гепатитов

Посетите раздел других видео уроков по эпидемиологии.

— Также рекомендуем «Вирус гепатита В и его антигены»

Оглавление темы «Диагностика вирусных гепатитов»:

1. Подтверждение или исключение гепатита D и гепатита С у детей
2. ИФА в диагностике вирусных гепатитов. Возможности иммуноферментного анализа
3. Вирус гепатита В и его антигены
4. Мутации вируса гепатита В. Генетическая изменчивость ВГВ
5. Заражение гепатитом В после прививки. Иммунитет к вирусу гепатита В
6. Варианты HBsAg гепатита В и их распространение
7. Современная диагностика гепатита В. Выявление HBsAg
8. Вирус гепатита С и его геном
9. Белки и антигены вируса гепатита С. Диагностика ВГС
10. Современная диагностика вирусного гепатита А. Антигены HAV