Иммуноферментный анализ на гепатит с что это

Достоверность анализа

Чтобы оценить работоспособность защитных функций организма и выявить точные диагностические данные, проводят иммуноферментный анализ. В случаях инфицирования человека обнаруживаются кардинальные изменения в крови и получают результат ИФА на гепатит С положительный.

Метод изучения биологического материала ИФА относят к определению иммунохимических реакций, открывающих взаимосвязи антигенов и антител. В ходе проведения анализа к молекуле антитела химическим способом подсаживают антиген-экзим, служащий маркером, который указывает на компоненты процесса.

К компонентам иммуноферментного анализа относят:

• антитела:
• антитела промаркированные;
• antibodies-attacking-a-virus1-440×264 антиген;
• субстрат фермента;
• краситель-индикатор.

Процесс выработки антител и иммуноглобулинов запускается в момент проникания в организм пациента посторонних генов или болезнетворных бактерий.

Задачей иммуноглобулинов считают нейтрализацию антигенов, происходящую при их взаимодействии. В ходе взаимодействия иммуноглобулины формируют комплект антиген-антител, которые имеют количественные и качественные характеристики. Эти значения и изучаются в процессе исследования анализа.

Для регистрации результата в ходе тестирования иммуноферментного анализа у человека забирают биологический материал. Обычно для этих целей используют венозную кровь, но в определенных ситуациях необходим анализ спинномозговой жидкости, стекловидного тела или околоплодных вод беременной женщины. Главной особенностью этого теста является его высокая достоверность, которая составляет порядка 80%.

К плюсам иммуноферментного анализа также относят:

• метод ИФА превосходит прочие тесты по точности определения важных показателей в десятки раз;
• для выполнения ИФА не требуется много времени, результаты, подтверждающие или опровергающие наличие вируса в организме, получают довольно быстро;
• стоимость проведения ИФА доступна большинству категорий населения, в отличие от прочих тестов;
• проведение ИФА дает возможность обнаружить проблему при начальных проявлениях, что значительно облегчает последующий процесс лечения человека;
• все стадии проведения этого анализа автоматизированы;
• высокая степень унификации теста.

К негативным проявлениям данного анализа относят возможность ложноположительных и отрицательных результатов. Сомнительные итоги могут регистрироваться при различных патологических состояниях, беременности и при употреблении медикаментозных средств, которые влияют на выработку организмом антител.

Ложноположительный результат

Вирус гепатита С

С помощью проведения иммуноферментного анализа подсчитывается количество антител к вирусу гепатита С. В ходе исследования определяется число этих образований по IgM типу, который соответствует острому течению недуга и IgG, обнаруживаемому при хронической форме.

Антитела IgM регистрируют в течение двух недель после инфицирования организма пациента вирусом гриппа С в острой форме, срок существования этих образований от 3 до 5 месяцев.

Антитела IgG вырабатываются спустя несколько месяцев после поражения организма, но их существование подтверждается в течение десяти лет, даже при условии полного выздоровления пациента.

Отрицательный результат тестирования дает возможность утверждать, что антитела обоих типов отсутствуют в организме и на данный момент гепатит С не обнаружен. Следует учитывать, что если человек заразился в течение последних двух недель, определение патологии невозможно.

Положительный результат теста показывает наличие того или иного типа антител в организме пациента. Данный показатель характеризует инфицирование гепатитом С в острой или хронической форме. Следует учитывать, что фиксация этих образований не дает возможность однозначно указывать на заражение человека, вполне допустимо, что он является только носителем. Бывают случаи, когда при расшифровке данных фиксируется ложноположительный результат.

Это происходит в результате фиксирования лабораторными приборами антител, которые производятся защитной системой человека в ответ на следующие патологии:

• аутоиммунное воспаление;
• проникновение в организм пациента прочих инфекций;
• при беременности.

Статистика проведения иммуноферментного исследования показывает, что ложноположительный вывод регистрируется в 15% всех результатов, подтверждающих наличие вируса. Для беременных женщин данный показатель еще выше.

Причины ложноположительных результатов

Недостоверный вывод тестирования на гепатит С выявляется при сбоях функционирования внутренних органов и технических сбоев, то есть халатного отношения медицинского персонала к своим обязанностям. Ошибки обнаруживаются не более чем в 15% случаев, но их можно избежать, выполняя следующие правила:

Перед сдачей анализа нельзя курить

• для сдачи анализа необходимо выбирать только проверенные, сертифицированные лаборатории с обученным медицинским персоналом;
• накануне проведения анализов следует прекратить употребление любых медикаментозных препаратов, если прием лекарства обусловлен состоянием пациента, он должен предупредить персонал лаборатории об этом факте;
• процедура обычно проводится утром натощак, но перед этим пациенту не следует проявлять излишнюю физическую активность и курить;
• непосредственно перед проведением анализа рекомендуется определить температуру тела, она не должна превышать норму.

При сомнении в правильности выводов тестирования, назначается повторный анализ. В идеале требуется проведение трех исследований биологического материала на гепатит С.

Если первый тест показал наличие антител в крови пациента, а последующие два не выявили эти образования, можно утверждать, что инфицирования организма вирусом гепатита С нет. Существует ряд заболеваний, которые влияют на результат тестирования крови на наличие вируса гепатита С.

https://youtu.be/WckrECLnx3I

Некоторые патологии сопровождаются выработкой антител, и в этом случае подтверждение наличия вируса гепатита С в организме пациента производится с помощью других методов исследования, так как многократно повторяющиеся ошибки при ИФА анализе не дают гарантии правильного диагноза.

Комплексное изучение с применением исследования биологического материала человека в лабораторных условиях и с использованием инструментальных методов позволит выявить истинную причину недомогания, и исключить гепатит С.

Чаще всего причиной ложноположительного результата анализа являются следующие патологии:

• инфекционные заболевания острого или хронического типа;
• рак или доброкачественные новообразования во внутренних органах;
• заболевания аутоиммунного типа, при течении которых образуются антитела к собственным клеткам организма пациента;
• туберкулез;
• малярия;
• склеродермия;
• герпес;
• рассеянный склероз;
• артрит.

Все перечисленные заболевания являются причиной возникновения сбоев в иммунной системе человека, в результате чего иммуноглобулины начинают вырабатываться с превышением нормы, что и становится помехой для постановки точного диагноза и подтверждения наличия вируса гепатита С в организме пациента.

После соприкосновения с источником инфекции организм человека может успешно подавить воспаление, но антитела, при проведении ИФА, все еще обнаруживались в крови, что стало причиной ложноположительного результата теста.

Довольно часто такой результат тестирования регистрируется у беременных женщин, поэтому без повторного анализа, подтверждение заболевания у такого пациента, не проводится.

Причиной отклонений от нормы становится изменения в организме женщины, которая ждет ребенка. В этот период у нее происходит перестройка внутренних органов, что выражается в следующих процессах:

• изменяется гормональный фон;
• в крови формируются специфические белки, вследствие чего меняется ее состав;
• уровень цитокинов увеличивается.

Помимо перечисленных факторов, влияющих на итоги иммуноферментного анализа, нужно отметить ошибки медицинского персонала, приводящие к обнаружению ложноположительных выводов тестирования:

• недостаточная квалификация персонала, проводящего забор биологического материала;
• сбои в функционировании лабораторного оборудования;
• подмена проб по халатности;
• ненадлежащее хранение биологического материала (нарушение температурного режима).

При проведении иммуноферментного анализа следует учитывать, что пациент мог недавно получить прививку против гриппа, гепатита или столбняка. Этот факт нужно обязательно довести до сведения лечащего врача или медицинского персонала в лаборатории, чтобы была назначена другая дата исследования.

Что делать, если результат положительный

Регистрация антител в биологическом материале пациента, указывающая на присутствие вируса гепатита С в организме, не всегда является окончательным диагнозом заболевания. Ложноположительные результаты иммуноферментного анализа нередки, и повторные тесты часто опровергают первоначальные выводы.

При положительных анализах нужно обратиться к гепатологу

Нужно понимать, что ИФА тест дает возможность выявить количественные и качественные изменения в биологическом материале человека и определить характер течения заболевания. Делать окончательное заключение об инфицировании гепатитом С можно только после комплексного изучения состояния пациента с применением других лабораторных и инструментальных исследований.

Если положительный результат выявлен надлежащим образом, человеку следует отправиться к специалистам: инфекционисту и гепатологу. Только профильный врач сможет определить, какие тесты необходимо пройти дополнительно до назначения курса терапии

По данным медицинской статистики, в мире инфицировано гепатитом С почти 4% населения, но этот показатель явно занижен, так как многие носители недуга не подозревают о своей проблеме. Поэтому проведение ИФА теста в качестве профилактической меры поможет выявить заболевание на начальной стадии и быстро справиться с болезнью.

Констатация HCV-инфекции базируется на  выявлении специфических серологических маркеров. Это важно не только для дифференциальной диагностики гепатита С, но  и для суждения о стадии заболевания, прогнозировании его течения, оценки активности процесса и эффективности противовирусной терапии.

Наиболее широко практикуется определение антиHCV антител. Принципиальное значение имеет генодиагностика, основанная на детекции РНК HCV. Недавно появилась возможность обнаружения  циркулирующих HCV антигенов.

 Метод ИФА

Выявление антиHCV антител проводят при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на основе комплекса  структурных и неструктурных вирусных пептидов.  В настоящее время применяются диагностические системы 3го поколения,  которые построены из рекомбинантных и/или синтетических фрагментов структурных и неструктурных HCVбелков (С, NS3, NS4 и NS5). Внедрение диагностикумов 3-го поколения позволило сократить сроки первичного выявления антиHCV при острой инфекции, существенно повысить чувствительность и специфичность реакции (рис 1).

  Рис.1 Детекция маркеров HCV тестами разных поколений

Частота выявления анти-HCV среди РНК HCV позитивных образцов крови приближается к 100 %. На фоне хронической инфекции антитела выявляются постоянно,  а после элиминации вируса сохраняются (прежде всего, анти-С) в течение 48 и более лет. Поэтому формальное наличие анти HCV не всегда говорит о присутствии вируса в организме и не позволяет судить об активности процесса. Для суждения о вирусной нагрузке, активности HCV репликации,  риска хронизации, разграничения острого и хронического гепатита, длительности инфекционного процесса и степени поражения печени   предложено использовать  определение спектра антител к различным HCV пептидам, а также наблюдать за их качественной и количественной динамикой. Это дает ориентировочную информацию, которая требует подтверждения другими методами.

Детекция антител  к каждому из HCV антигенов имеет самостоятельное диагностическое значение. Так например известно, что анти core, анти Е и анти NS3 выявляются на самых ранних этапах сероконверсии, анти NS4 и анти NS5, как правило, появляются позднее. По мере развития инфекционного процесса титры выявляемых анти HCV увеличиваются.

Было показано, что наличие в сыворотке анти HCV core является достаточно надежным  маркером вирусной репликации, поскольку имеются данные о том, что  их присутствие коррелирует с наличием в сыворотке специфической м РНК.

Анти НCV core тест может использоваться в качестве подтверждающего теста при тестировании образцов с «неопределенными» результатами. Сыворотки крови, в которых анти НCV core детектируется в  разведении 1:1000 с большой вероятностью содержат вирус и являются реально позитивными. Образцы, являющиеся позитивными в разведении 1:200 и отрицательными в разведении 1:1000, необходимо в дальнейшем исследовать на наличие вирусной РНК. С большой вероятность эти сыворотки можно отнести к реально негативным.  Таким образом, используя предварительный анти HCV core тест можно существенно снизить количество образцов, требующих подтверждения   методом ПЦР.

Анти NS3 могут являться самостоятельным диагностическим маркёром острой НCV инфекции. Высокие титры анти NS3 при остром гепатите С свидетельствуют о  значительной вирусной нагрузке, а длительное сохранение их в острой фазе связано с высоким риском хронизации инфекционного процесса.

Выявление анти NS4 и высокие титры этих антител чаще всего свидетельствуют о длительности инфекционного процесса, и, по всей видимости, коррелируют со степенью поражения печени.

Имеются данные, говорящие о том, что выявление антитNS5 в высоких  титрах часто свидетельствует о присутствии вирусной РНК, а в острой стадии является предиктором хронизации инфекционного процесса. Также имеются данные о  том, что в NS5 области вируса гепатита С имеются последовательности, неспецифически реагирующие с антителами в сыворотках крови человека. При помощи синтетических пептидов было проведено эпитопное картирование этой области, и были найдены последовательности, специфически реагирующие с антителами, вырабатываемыми именно к вирусу гепатита С.

Большое значение для клинической практики может иметь выявление анти Е1/Е2. Выявление анти Е в течение 1 месяца от начала заболевания и быстрое последующее снижение  может свидетельствовать об очищении организма от вирусной РНК, определение анти Е при хроническом гепатите С свидетельствует об активной вирусной репликации.

Для многих вирусных заболеваний, таких как гепатит В, гепатит Д, гепатит А, определение антител класса IgM к различным вирусным маркерам является важным диагностическим показателем острой или хронической инфекции. Важность определения антител этого класса при инфекции вируса гепатита С остается не вполне ясной. Разными авторами получены противоречащие друг другу результаты.  Вопреки ожиданиям IgM ответ в острой фазе  гепатита С не следует классическому пути антителообразования: IgM анти HCV могут выявляться одновременно и даже позднее, чем анти HCV класса IgG. Поэтому обнаружение IgM анти HCV  не может быть использовано как маркер острой HCV инфекции. Вместе с тем длительность циркуляции антикор IgM (35 месяцев)  является фактором, прогнозирующим персистентную инфекцию, а их появление  при хроническом гепатите С свидетельствует о реактивации вируса, т.е. об обострении процесса. Этому соответствует корреляция между темпами снижения антикор IgM и эффективностью противовирусной терапии.

Иммунблотинг

Иммунблотинг (англ. «blot»  пятно) основан на дифференцированном определении антител к различным антигенам (С,  NS3, NS4 и NS5),  которые в виде дискретных фракций  («пятен») фиксируются  на  нитроцеллюлозных полосках и после инкубации с исследуемой сывороткой проявляются мечеными антителами так же, как в «обычном» ИФА. Результат считается положительным при выявлении антител к двум и более антигенам.    

Несмотря на высокую специфичность, современные ИФА-системы не гарантированы от гипердиагностики, т.е. от ложноположительных результатов. Для их исключения  также требуется динамическая оценка на основе  индикации анти HCV к дискретным антигенам (подтверждающие, или конфирмативные тесты).

Наряду с ложноположительными возможны и ложноотрицательные результаты, когда анти HCV антитела не удается обнаружить несмотря на присутствие вируса в организме. Известны по меньшей мере три подобных ситуации:

1) начальный период заболевания (серонегативная фаза острого гепатита  фаза «окна»),

2) больные, получающие иммунодепрессанты (они могут  быть  длительно  инфицированы без сероконверсии),

3) заражение некоторыми HCV генотипами (прежде всего  3  и  4).  

В настоящее время  коммерческие тесты для выявления антител к вирусу гепатита С используют в качестве антигенов рекомбинантные белки или синтетические пептиды, созданные на основе аминокислотной последовательности вируса гепатита C 1-го генотипа.  Однако, растет число наблюдений, что такие тесты могут быть недостаточно эффективны для надежной детекции антител при инфицировании вирусом другого генотипа. Так, например, было показано, что антигены, полученные из  NS3 области  HCV 1-го генотипа, в 5 раз более эффективно узнают антитела в сыворотках больных, инфицированных вирусом HCV 1го генотипа, чем в сыворотках больных, инфицированных вирусом 2го или 3го генотипа. Исследования, проведенные L Bassit  (2002)  продемонстрировали неспособность нескольких коммерческих тестов адекватно детектировать антитела к вирусу гепатита С у больных, инфицированных вирусом 1а и 3а типов. Это наблюдение имеет огромное значение как для регионов, где превалируют вирусы других типов, так и для отдельных популяций.

Таким образом, для эффективной диагностики гепатита С  необходим высокочувствительный тест, способный адекватно реагировать с анти-ВГС любого генотипа. 

Кроме прямого изучения структуры РНК, информация о зараженности конкретным генотипом  может быть получена  на основе изучения антител против генотипоспецифических эпитопов, локализованных в NS5, NS4 и С  белках вируса. Перечень серотипируемых вариантов HCV в настоящее время включает генотипы (субтипы) 1a, 1b, 2a, 2b, 3a и 4а. Результаты серотипирования и РНК-типирования совпадают в 50-95% случаев, в зависимости от генотипа. Осуществляется коммерческий выпуск диагностических препаратов для серотипирования в планшетном варианте ИФА и иммуноблоте.