Ложный анализ ифа на гепатит с

Вирусом гепатита С заражено около 170 миллионов человек по всему миру. Болезнь коварная – при смазанной симптоматике начала заболевания ее дебют проходит незамеченным. Часто развиваются хронические формы, которые приводят к разрушению клеток печени.

Исходом гепатита С становятся цирроз или рак печени. Для выявления маркеров заболевания в первую очередь назначают иммуноферментный анализ – ИФА на гепатит С.

Что такое ИФА?

Анализ основан на способности специфических антител (белков крови) связываться с антигеном (частицами вируса), при этом один из них «помечен» ферментом. Образовавшийся комплекс реагирует с подкрашенным субстратом, что фиксируется спектрофотометрическими методами.

Иммуноферментный анализ (ИФА) на гепатит С показывает не присутствие самого вируса-возбудителя в крови, а ответ иммунной системы на столкновение с ним. Количество вируса в крови на момент проведения ИФА может быть ничтожно мало, за порогом определения. А антитела – иммуноглобулины, которые выработались при встрече с «агрессором», продолжают циркулировать в кровеносной системе.

Именно присутствие антител определяется при ИФА. Появляются они в срок от нескольких дней до нескольких недель после заражения гепатитом С.

ИФА выявляет циркулирующие иммуноглобулины даже в малой концентрации. По их типу можно судить о давности заболевания. В острый период, когда вирус гепатита активно размножается, определяют иммуноглобулины класса М.

В хронической стадии (спустя 6 мес. от начала заболевания) при ИФА обнаруживают иммуноглобулины класса G. Последний тип также может свидетельствовать не о хронизации процесса, а о самом факте столкновения иммунной системы с вирусом гепатита С в прошлом.

Показания к ИФА на гепатит С

Обследование на маркеры гепатита С, к которым относятся антитела – иммуноглобулины, давно стала рутинной процедурой. ИФА назначают при:

острых и хронических заболеваниях печени;

желтухе неясного генеза;

обследовании перед хирургическими вмешательствами;

стандартном обследовании доноров крови;

постановке на учет в женской консультации при беременности. Повторно анализ сдают за 2-4 недели до предполагаемой даты родов;

прохождении гемодиализа;

профилактических осмотрах медработникам, контактирующим с компонентами крови и другими биологическими жидкостями;

незащищенном сомнительном половом контакте;

рождении детей от инфицированных матерей.

В порядке рекомендаций анализ на гепатит С назначают родственникам больного, близко с ним контактирующим. В 50% случаев парентеральный источник заражения выявить не удается. Инфекционисты предполагают бытовой путь передачи, когда зараженная кровь может попадать в кровоток здорового человека через кожные ранки и трещины. У этой версии много противников.

Как проводится анализ?

За 48 часов до ИФА исключают из пищи алкоголь, жареное, жирное и соленое. За 12 часов до забора крови из вены пациенту необходимо воздержаться от приема каких-либо лекарств. Анализ сдают утром натощак.

Наибольшее распространение получил «твердофазный» ИФА. Твердая фаза – это материал, на котором фиксируют антитела или антигены. В этом качестве используют мембраны, активно собирающие на себя белки (лабораторные планшеты, стенки пробирки, шарики и бусины из полипропилена или поливинилхлорида, нитроцеллюлозу и пр.).

Вне зависимости от разновидности ИФА, в его проведении существует строгая этапность:

На первой стадии исследуемый материал «узнается» специфическим антителом и связывается с ним, образуя иммунный комплекс;
На второй стадии с образовавшимся иммунным комплексом реагирует помеченный ферментом так называемый конъюгат – антитело или антиген;
Заключительная стадия ИФА позволяет уловить и зарегистрировать сигнал от ферментной метки.

Виды ИФА

Вариантов выполнения анализа достаточно много. Их классифицируют:

По типу реагентов, используемых на первом этапе ИФА:
a) конкурентный;
b) неконкурентный;

По степени однородности среды, в которой происходят реакции ИФА:
a) гомогенные;
b) гетерогенные;

3) По принципу определения исследуемого вещества:
a) прямой;
b) непрямой. Именно непрямой метод ИФА используется при выявлении маркеров гепатита С.

Прямой метод ИФА

При этом методе используют стандартные антитела к вирусу гепатита С, помеченные меткой – ферментом.

В лунки лабораторного планшета (если выбрали именно его в качестве твердой фазы) помещают сыворотку крови пациента. Выдерживают 20 минут, чтобы антигены (белки вируса гепатита С) успели прикрепиться к стенкам.
Добавляют стандартные помеченные ферментом антитела к гепатиту С. Выдерживают еще несколько часов – за это время образуются иммунные комплексы антиген-антитело с меткой. Чем больше антигенов в исследуемой сыворотке, тем больше таких комплексов образуется.
Содержимое лунок промывается от несвязанных белков. Затем добавляют субстрат. Это вещество при реакции с ферментом-меткой меняет цвет. Чем больше комплексов при ИФА образовалось, тем большее количество фермента может воздействовать на субстрат и тем ярче хроматографическая реакция. Она считывается ИФА-ридером и оценивается количественно.

Непрямой метод

При этом методе ИФА стандартный антиген связывается с антителами сыворотки пациента. К образовавшемуся иммунному комплексу добавляют меченые ферментом стандартные антитела к иммуноглобулинам.

В лунки лабораторного планшета помещают стандартный антиген гепатита С (частички вируса). Антиген прикрепляется к стенке, незакрепленные белки вымываются лаборантом.
В подготовленные таким образом лунки помещают исследуемый материал (сыворотку крови), инкубируют. Есть обязательные контрольные лунки со стандартными реагентами. За время инкубации образуются комплексы антиген-антитело. Непрореагировавшие компоненты опять вымывают.
В лунки добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам М и G. Эти белки прореагируют с образовавшимся ранее комплексом, только если в исследуемом образце есть антитела к гепатиту С. Промывают.
Добавляют еще один компонент – субстрат. Это химическое соединение разрушается ферментом из комплекса антиген-антитело. При этом образуется окрашенное вещество, количество которого фиксируют специальным прибором – ИФА-ридером. Чем больше фермента, тем сильнее он прореагирует с субстратом и тем ярче будет цветовой сигнал.

Расшифровка результатов

Высокая чувствительность ИФА иногда играет с пациентом злую шутку. Не каждый положительный результат означает заболевание и не каждый отрицательный – гарантия свободы от вируса.

При положительном ИФА определяют генотип вируса и определяют количество циркулирующих в крови вирусов с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Положительный

При ИФА выявляют маркеры острой фазы заболевания (иммуноглобулины класса М (IgM)) и иммуноглобулины класса G (IgG). Последние могут означать, что у пациента хронический гепатит С или то, что иммунная система хотя бы раз в прошлом сталкивалась с этим вирусом и выработался иммунитет.

Выявление одновременно двух типов иммуноглобулинов при ИФА говорит об обострении хронического гепатита С.

Отрицательный

Самый вероятный вариант – пациент не болен и его иммунная система никогда не сталкивалась с вирусом.

Псевдоотрицательный результат при ИФА можно получить в том случае, если пациент инфицировался относительно недавно и защитные антитела просто не успели выработаться. Это так называемое «диагностическое окно». Его срок – 6 месяцев.

Наконец, нельзя полностью исключить ошибку лаборатории.

Ложноположительный

ИФА реже дает погрешности по сравнению с ПЦР. Тем не менее, исследуемые вещества – белки. Реагент может связаться с неспецифическим белком сыворотки крови. Ложноположительный ИФА на гепатит С нередок в случаях:

выполненной накануне вакцинации;

при аутоиммунных патологиях или туберкулезе, рассеянном склерозе, склеродермии;

опухолевом процессе;

инфекциях, протекающих с гипертермией (грипп, ОРЗ и пр.).

Грешат ложноположительными результатами исследования на маркеры гепатита С у беременных. Довольно часто ИФА дает ложное заключение о наличии антител пациентам со II группой крови.

ИФА положительный, а ПЦР отрицательный: что это значит?

Полимеразная цепная реакция выявляет присутствие вируса в крови и его количество, помогает определить генотип. ИФА «видит» антитела – клетки, вырабатываемые спустя какое-то время после инфицирования и остающиеся в организме после уничтожения «врага».

Вариантов, при которых у пациентов с гепатитом С ПЦР отрицательный, а ИФА – положительный, два. Самый вероятный – сформировался иммунитет к вирусу, а сам он уничтожен иммунной системой или лекарствами.

Второй: нельзя исключить ошибку лаборатории при проведении ПЦР.

Диагностикой заболеваний должен заниматься врач. Он учитывает все нюансы обследования. А лабораторная диагностика, в том числе ИФА – только вспомогательный метод, не лишенный погрешностей.

Источник

Специфические лабораторные методы применяются для диагностики гепатита С. К ним относятся иммунохимические, молекулярно-биологические анализы распознавания РНК-содержащего вируса (ВГС).

Интерпретация полученных данных зависит от:

Чувствительности применяемого метода. Это способ определения минимального компонента в величине разведения — антител, антигенов, нуклеиновых кислот. Выражается в количественных единицах — титрах.
Специфичности конкретного метода, способного выявить ВГС и антитела к нему

Цель работника лаборатории заключается в разграничении ложноположительных анализов на гепатит С и обнаружение вируса и антител к нему.

Вы знаете, кому нужно сдавать анализы на гепатит С?

ДаНет, расскажите

Анализы на гепатит С

Постановка диагноза HСV-инфекции происходит с помощью вирусологических (ПЦР) и серологических тестов (ИФА).Симптоматика острой фазы заболевания практически отсутствует, но уже в первые 7-14 дней после инфицирования диагностировать этот период гепатита С можно при обнаружении РНК методом ПЦР.

Применение ИФА в этой стадии не результативно, так как антитела вырабатываются через несколько недель. Изобретение тестовых систем 3 поколения способствует определению IgM в ранние сроки. Метод используют в лабораториях, но он не отвечает целям полной диагностики и оценки эффективности лечения.

ИФА

Метод иммуноферментного анализа разработан в трех вариантах: иммуноферментный, радиоиммунный, флюороиммунный. Востребован твердофазный ИФА. В постановке реакции он прост, высокочувствителен и относительно не дорог.

В зависимости от агента, который определяют – антиген или антитело, ИФА представляет разную ценность в диагностике. Верные результаты получаются при выявлении вирусных антигенов. Это также не является критерием постановки диагноза, так как часть антигенов расположена только в печеночной ткани и в крови обнаружить их не возможно. Поэтому нужно применять ИФА с определением сразу двух видов вирусных антигенов.

При обнаружении антител к ВГС нельзя говорить о присутствии вируса. Выявлены случаи когда анализ ИФА оказывается ложноположительным у обследуемого. Это указывает на иммунологическую память ранее присутствующего вируса в организме.

В проведенных исследованиях 957 проб с положительным ИФА потребовались другие арбитражные методы — ПЦР. В итоге у 36,6% РНК не обнаружилось, что свидетельствует о получении ложноположительного ответа.

Разработанные за последнее десятилетие новые тестовые системы способны одновременно определять антитела и антигены к вирусу гепатита С.

ПЦР

Этот метод детекции — полимеразная цепная реакция, создан для обнаружения вирусной РНК в образце сыворотки крови. Исследование заключается в многоцикловом процессе, который состоит из переходящих друг в друга этапов.

С помощью применения обратной транскриптазы (фермента) образуются молекулы ДНК вируса гепатита С. Итоговый результат — выделение вирусной рибонуклеиновой кислоты. Количественный вариант ПЦР используют для определения концентрации РНК. Исследуется количество копий в 1 мл. Выражается в логарифмических выражениях (log10).

Для прогнозирования эффективности лечения важным является выяснение принадлежности гепатита С к генотипу. В проведении генотипирования используют типоспецифические праймеры, в методах основанных на методике ПЦР.

Чувствительным методом определения нуклеиновых кислот считается «ПЦР в реальном времени». С помощью этого метода получают результат в ходе реакции даже при малом количестве нуклеиновых кислот. Полученные показатели с высокой точностью определяют уровень вирусной нагрузки.

Может ли анализ на гепатит С быть ошибочным?

На сегодня по-прежнему остается шанс получения ложноположительного результата на наличие анти-ВГС. При определенных обстоятельствах искаженные данные получаются при проведении ИФА и ПЦР.

Доля ошибочных ложноположительных результатов составляет 10-20%.

Для уточнения нахождения вируса в крови обследуемого человека применяют метод обнаружения РНК совместно с другими чувствительными методами. Однако получение отрицательного ответа не свидетельствует о ложноположительном ответе. В случаях полного выздоровления пациентов (10-15%) в крови возможно присутствие анти-ВГС.

Получение ложноположительного результата зависит от естественных причин:

появление мутантных штаммов;
репродукции антител и антигенов возбудителя.

Причины ложноположительного анализа

Ошибочный анализ регистрируется в виде ложнонегативных и ложнопозитивных результатов.

Ложноположительный ответ получается при:

смешении исследуемого образца с предыдущим через лабораторное оборудование или аэрозоли;
соединение между пробами при работе с реакционной смесью.

Ложноотрицательные ответы определения РНК получаются при:

нарушениях правил перевозки клинических образцов;
несоблюдении теплового режима образцов крови;
распад РНК при подготовке к пробе;
поэтапное прохождение ПЦР нарушает гепарин и высокий уровень криоглобулинов;
присутствие в сыворотке белковых, химических субстанций.

Распространенные причины ошибок анализов связаны с:

иммунодефицитными состояниями;
онкологией;
аутоиммунными заболеваниями (синдром Рейно, полинейропатия, узелковый периартериит и другие);
поражениями системы крови (тромбоцитопения, гемолитическая анемия);
глистными инвазиями;
сифилисом.

Человеческий фактор

Ошибка в анализе возможна с учетом действия работников, участвующих в процессе, с процедурного кабинета и до клинической лаборатории.

Человеческий фактор возможен при:

нарушении нумерации пробирок в момент забора крови;
указании ошибочного ответа;
неправильных действиях лаборанта в ходе подготовки образца;
проведении пробы в условиях повышенной комнатной температуры;
неопытности молодого специалиста;
изготовлении некачественных диагностических препаратов.

Моментом, который способен искажать данные исследований является алкоголь. Это своеобразный антидепрессант, который воздействует на диагностику гепатита С. У пьющих людей с хронической формой выявляться HCV РНК при отсутствии антител и наоборот.

Ложноположительный результат у беременных

Установленный гепатит С ложноположительный у беременной женщины может быть связан с физиологическими изменениями происходящими в организме в период вынашивания плода:

выработку характерных гестационному периоду белков;
полную перестройку гормональной системы;
повышение концентрации противовоспалительных цитокининов;
изменение биохимических показателей;
присоединение инфекций бактериального и вирусного генеза.

Инфекционные заболевания

Инфекционные заболевания протекают с выделением антител (защитные факторы крови) в ответ на антигены (болезнетворные возбудители). Работа иммунитета человека заключается в выработке иммуноглобулинов в ответ на проникновение чужеродных агентов.

Одновременное выделение иммуноглобулинов при инфекционном процессе в сочетании с гепатитом С искажает результаты анализов ИФА, что ведет к возрастанию количества ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Инфекции, которые приводят к ошибке:

токсоплазмоз;
цитомегаловирус;
передающиеся половым путем (уреаплазма, микоплазма, трихомоноз).

Лабораторная диагностика гепатита С при коинфекции с ВИЧ затруднена. Ложноотрицательный ИФА по выявлению анти-ВГС связан с формированием иммунодефицита у человека. Поэтому всегда проводится исследование РНК методом ПЦР.

Как избежать ложноположительного результата?

Ошибочный диагноз гепатита сводят к минимуму благодаря:

качественному обучению лабораторных работников и прохождению курсов повышения квалификации;
проведению этапов ПЦР в изолированных зонах;
применению автоматических пипеток для каждого этапа реакции;
проведение дополнительных анализов для уточнения.

Исключить ложноположительный результат возможно при проведении дополнительных (supplemental) тестов. Это препараты, созданные специально для определения антител к конкретным белкам, кодированных разными зонами вирусной РНК.

Внедрение новых методик лабораторного исследования вирусного гепатита С обеспечивает раннюю диагностику заболевания и сводит к минимуму появление ложных результатов. Это мера способствует своевременно начатому лечению, которое заканчивается выздоровлением.

( 1 оценка, среднее 5 из 5 )

Источник