Метформин и цирроз печени

Metformin Inhibits Glutaminase Activity and Protects against Hepatic Encephalopathy
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499552/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: JA MRG. Выполнены эксперименты: IR MdMDH JAdC AR IC JDB. Проанализированы данные: JA MRG. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: DN MM BF. Написал газету: JA MRG.

Изучить влияние использования метформина на дисфункцию печени и печеночную энцефалопатию в ретроспективной когорте пациентов с диабетической циррозой. Проанализировать влияние метформина на активность глутаминазы и производство аммиака in vitro.

Восемьдесят два пациента с циррозом с диабетом 2 типа были включены. Сорок один пациент был классифицирован как чувствительный к инсулину сенсибилизатор (метформин) и 41 в качестве контроля (цирротические пациенты с сахарным диабетом 2-го типа без лечения метформином). Исходный анализ включал: инсулин, глюкозу, глюкагон, лептин, адипонектин, TNFr2, AST, ALT. HOMA-IR рассчитывали. Базовый уровень риска HE рассчитывали в соответствии с минимальной печеночной энцефалопатией, оральным глютамином и мутациями гена глутаминазы. Мы провели экспериментальное исследование in vitro, включая анализ ферментативной активности, где ингибирование глутаминазы измеряли в соответствии с различными концентрациями метформина. В клетках Caco2 ингибирование активности глутаминазы оценивали путем производства аммиака через 24, 48 и 72 часа после обработки метформином.

Печеночная энцефалопатия была диагностирована во время наблюдения в 23,2% (19/82): 4,9% (2/41) у пациентов, получавших метформин и 41,5% (17/41) у пациентов без лечения метформином (logRank 9,81, p = 0,002). При многофакторном анализе используют метформин [H.R.11.4 (95% ДИ: 1,2-108,8); p = 0,034], возраст при постановке диагноза [H.R.1.12 (95% ДИ: 1,04-1,2); p = 0,002], женский пол [H.R.10.4 (95% ДИ: 1,5-71,6); p = 0,017] и риск HE [H.R.21.3 (95% ДИ: 2,8-163,4); p = 0,003] независимо были связаны с печеночной энцефалопатией. В ферментативном анализе ингибирование активности глутаминазы достигало 68% с метформином 100 мМ. В клетках Caco2 метформин (20 мМ) уменьшал активность глютаминазы до 24% через 72 часа после лечения (р

Метформин был обнаружен независимо от явной энцефалопатии печени у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и высоким риском развития печеночной энцефалопатии. Метформин ингибирует активность глутаминазы in vitro. Поэтому использование метформина, по-видимому, защищает от печеночной энцефалопатии у пациентов с диабетической циррозой.

Печеночная энцефалопатия (ОН) является одним из основных осложнений цирроза печени, влияющих на треть пациентов с циррозом [1]. Он имеет соответствующее социально-экономическое воздействие, поскольку ОН снижает качество жизни и связан с более высокой смертностью [2]. ОН возникает в результате сосуществования гипераммонемии и воспаления у пациентов с дисфункцией печени и / или порто-системных шунтов [3]. Производство аммиака происходит главным образом в тонком кишечнике, где активность активности глутаминазы типа K имеет решающее значение для патогенеза HE [4]. Сахарный диабет 2 типа и резистентность к инсулину (IR) характеризуются высвобождением провоспалительных цитокинов, таких как TNFα и IL-6, что приводит к воспалительному состоянию [5]. Диабет независимо связан с контролем активного варикозного кровотечения [6] и связан с повышенным риском развития гепатоцеллюлярной карциномы [7]. Также был обнаружен сахарный диабет 2-го типа, связанный с печеночной энцефалопатией у пациентов с циррозом, связанным с HCV [8]. Сенсибилизаторы инсулина, такие как метформин, уменьшают секрецию инсулина и уменьшают гиперинсулинемическое состояние. Метформин увеличивает бета-окисление и снижает печеночный глюконеогенез посредством активации пути AMP-K; уменьшает абсорбцию глюкозы в кишечнике и увеличивает поглощение глюкозы в скелетной мышце [9]. Недавно было обнаружено, что он способен модулировать экспрессию цитокинов, таких как TNFα [10]. Таким образом, инфракрасное состояние может влиять на развитие печеночной энцефалопатии у пациентов с циррозом. Сенсибилизаторы инсулина, по-видимому, уменьшают HCC у пациентов с циррозом C [11]. Поэтому производство аммиака, IR и провоспалительное состояние, по-видимому, вызывают развитие цирроза и могут быть интересными в качестве терапевтических целей в ближайшем будущем, улучшая прогноз пациентов с циррозом.

GLS: глутаминаза. ОГК: оральный вызов глютамина. MHE: минимальная печеночная энцефалопатия.

Целью этого исследования было определить, связано ли использование метформина с уменьшением риска печеночной энцефалопатии у пациентов с диабетической циррозом и для анализа способности метформина ингибировать активность глутаминазы in vitro.

Были включены восемьдесят два последовательных пациента с диабетической циррозом из отделения для клинического лечения заболеваний пищеварения, университетская больница Вальме. Исследование началось либо с первого посещения отделения гепатологии, либо с первой госпитализации, и результаты для завершения были выживания и трансплантации печени. Критерии исключения: возраст ≤18 лет; недиабетические пациенты; пациенты с сахарным диабетом 1-го типа; и пациентов с лечением, продолжающимся при циррозе. Протокол был одобрен CEIC Университетской больницы Вальме (Севилья, Испания), и все пациенты предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации и Международной конференцией по руководящим принципам гармонизации хорошей клинической практики. Всего было включено 41 дело и 41 контроль. Они были классифицированы в соответствии с опытными сенсибилизаторами инсулина. Случаи были определены как пациенты, которым проводилось лечение метформином, тогда как контроль определялся как цирротические пациенты с сахарным диабетом 2-го типа без лечения метформином. Среднее время, проведенное Metformin, составляло 33,4 ± 26,7 месяца. Диабет сахарного диабета 2 типа был диагностирован в соответствии с Американской диабетической ассоциацией
[12].

Базовый анализ с использованием коммерческих тестов включал: инсулин, глюкозу, глюкагон, TNFr2, лептин, адипонектин, АСТ и АЛТ. HOMA-IR рассчитывали [глюкоза (ммоль / л) * инсулин (МЕ / мл) / 22,5]. Цирроз был определен и основан на биопсии печени, ультразвуке, эндоскопическом анализе и биохимических параметрах.

Каждый бар представляет среднее ± SD (все эксперименты проводились в трех экземплярах).

3A) ингибирование активности глутаминазы в анализе клеток (%), в соответствии с концентрацией метформина; 3B) Концентрация аммиака в анализе клеток в соответствии с концентрацией метформина. Каждый бар представляет среднее ± SD (все эксперименты проводились в трех экземплярах). * p≤0,05 против соответствующего контрольного образца. # p≤0,05 против той же группы, собранной в предыдущий момент времени.

Минимальная печеночная энцефалопатия (MHE) была диагностирована на основании оценки психометрической печеночной энцефалопатии (PHES) и критической частоты фликкера (CFF) (анализатор Hepatonorm ™ (R & R Medi-Business Freiburg GmbH, Фрайбург, Германия)). Эта батарея содержит тест символа символа (DST), испытание на числовое соединение A (NCT-A), испытание на соединение номера B (NCT-B), тест последовательной точечной проверки (SDT) и тест линии (LDT). Пациенты были классифицированы как имеющие MHE, когда показатель PHES был меньше, чем -4 пункта, или значение CFF было ниже отсечки (38 Гц) [13]. Для анализа орального глютамина (OGC) образцы крови брали в начале и через 60 минут после нагрузки глютамина (10 г глутамина, растворенного в 100 мл воды (L-глутамин, SHS S.A., Испания)). Аммиак измеряли с использованием метода DaFonseca-Whollheim в автоанализаторе (Hitachi 911, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Кривая патологического ответа для толерантности к глютаминам определялась как увеличение аммиака до> 128 мкг / дл в течение 60 минут после приема глютамина [14]. Генетические исследования включали длину микросателлитов в 5’UTR-области гена глутаминазы вместе с гаплотипом TACC, как описано ранее [15]. Исходный высокий риск развития печеночной энцефалопатии определялся в соответствии с MHE, изменением OGC и генетическими изменениями. Пациенты с MHE (PHES 128 мг / дл в течение 60 минут) или показывающие генетический (большой / большой микросателлитный или не-TACC-гаплотип) были классифицированы как высокий риск развития HE (48%, 24/50), а остальные (52%, 26/50) — как низкий риск открытого ОН.

Мы провели экспериментальное исследование in vitro (химический анализ и анализ клеток) для исследования ингибирования активности глутаминазы в соответствии с различными концентрациями метформина.

Во-первых, в ферментативном анализе мы тестировали разные дозы метформина (0, 10, 25, 50 и 100 мкМ) с постоянной концентрацией глютамина (100 мМ). Производство аммиака измеряли для определения активности глютаминазы.

С другой стороны, клеточная линия клеточного эпителия млекопитающих человека Caco2 (American Type Culture Collection, ATCC) поддерживалась в среде DMEM с pH 7,4, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 2,2 г / л HCO3Na, 100 мМ пирувата натрия, 0,292 г / Л глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл амфотерицина в 5% СО2 при 37 ° С. Анализ клеток инициировали через 24 часа после посева. Клетки Caco2 (10000 клеток / см2) культивировали в присутствии разных доз метформина (0, 20, 50, 100 и 200 мМ) и образцы (клеточный осадок и культуральную среду) собирали после 0, 24, 48 и 72 часов после- лечение. Активность глютаминазы определяли путем измерения производства аммиака.

Результаты выражаются как среднее ± SD трех независимых экспериментов. Данные сравнивались с использованием теста ANOVA с критерием наименее значимой разницы (LSD) в качестве анализа после повторного сравнения. Мы использовали метод Каплана-Мейера (тест логарифма для сравнения кривых), Chi-square и T-student. Регрессия Кокса использовалась для одномерного анализа, и эти переменные с p

Базовый анализ эпидемиологических, биохимических и печеночных функций у обеих групп пациентов приведен в таблице 1. Различий в полах, возрасте, этиологии цирроза и функции печени (включая показатель Child-Pugh и MELD) не выявлено. Этиология цирроза — алкогольный цирроз (n = 46, 56,1%), связанный с HCV (n = 22, 26,8%), связанный с HBV (n = 2, 2,4%), криптогенный (n = 10, 12,3%) или аутоиммунный (n = 2, 2,4%). Распределение полов составляло 75,6% мужчин (62/82) и 24,4% женщин (20/82), средний возраст которых составлял 60,3 ± 9,5 лет. Функция печени в соответствии с стадией Ребенок-Пью: 57 пациентов (69,5%) на стадии «ребенок-Пью» А; 24 пациента (29,3%) на стадии B и 1 пациент (1,2%) на стадии C. Средний показатель Child-Pugh составил 6,1 ± 1,4, а оценка MELD составляла 9,5 ± 3,5. Средняя продолжительность наблюдения составила 42,5 ± 27,4 месяца. Девятнадцать пациентов (23,2%) разработали эпизоды открытого ОН во время наблюдения. Эти поединки были связаны с диуретиками (31,6%, 6/19), варикозным кровотечением (26,2%, 5/19) и инфекциями (15,8%, 3/19), спонтанными 26,4% (5/19). Однофакторный анализ, продемонстрированный измененными Child-Pugh, OGC, PHES, CFF, генетические факторы и использование метформина, был связан с риском открытой печеночной энцефалопатии (таблица 2). В группе метформина мы обнаружили 4,9% случаев (2/41), а 41,5% (17/41) имели место в контроле (log Rank 9.81, p = 0.002) (рис.1). В многофакторном анализе используют метформин [H.R. 11,4 (95% ДИ: 1,2-108,8); p = 0,034], возраст при постановке диагноза [H.R. 1,12 (95% ДИ: 1,04-1,2); p = 0,002], женский пол [H.R. 10,4 (95% ДИ: 1,5-71,6); p = 0,017] и риск HE [H.R. 21,3 (95% ДИ: 2,8-163,4); p = 0,003] независимо были связаны с EH (таблица 3). С другой стороны, общая выживаемость достигла тенденции у пациентов с циррозом metformin: 92,7% (38/41) группы МЕТ выжили и 82,9% (34/41) контролей.

Пациенты с MHE (PHES 128 мг / дл в течение 60 минут) или показывающие генетический профиль (крупный / большой микросателлитный или не-TACC-гаплотип) были классифицированы как высокий риск HE развитие. Использование Metformin в этих когортах было связано с более низкими поединками HE, как у пациентов с высоким риском, так и с низким риском (log Rank 7.57; p = 0.006).

В химическом анализе было получено 17,5% ингибирования активности глутаминазы при концентрации метформина 10 мМ и до 68% ингибирования достигали с использованием 100 мМ. Поэтому при использовании метформина наблюдалась доза-зависимая активность глутаминазы (рис.2). В клетках Caco2 20 мМ метформина показали 24% -ное ингибирование активности глутаминазы в 72 часа по сравнению с контролем в то же время (р

Основные результаты этой работы: во-первых, в экспериментальном исследовании мы получили частичное ингибирование активности глутаминазы (около 20%) как в анализе химических веществ, так и в клетках по сравнению с контрольными экспериментами. Глутаминаза превращает глутамин в глутаминовую кислоту, что незаменимо для функции клеток, вместе с аммиаком и свободными радикалами. Поэтому это частичное торможение, вероятно, достаточно для предотвращения осложнений у пациентов с циррозом (в частности, с печеночной энцефалопатией), сохраняя положительные эффекты глутаминазы. Во-вторых, мы наблюдали восьмикратный более низкий риск печеночной энцефалопатии у пациентов, получавших метформин (4,9% против 41,5%, p = 0,002), несмотря на то, что обе когорты были сходными по функции печени и по шкале высокого риска. Влияние Метформина на активность глутаминазы и воспалительное состояние (модулированное гликемическим контролем) могло бы объяснить, по крайней мере частично, этот результат. HOMA-IR коррелирует с реакционной активностью протеина-C, и пациенты, получающие metformin, показали тенденцию к снижению уровней TNFr2, чем пациенты, не получавшие метформин (данные не показаны). Интересно, что у пациентов с Child-Pugh A индекс HOMA был независимо связан с более высокой нормой открытого HE, поддерживая гипотезу о том, что синдром резистентности к инсулину может способствовать воспалению и повышенному риску открытого ОН. Действительно, фекальный кальпротектин коррелирует с критической частотой фликкера и градуировкой HE [16].

Было обнаружено, что сахарный диабет 2 типа связан с печеночной энцефалопатией у пациентов с циррозом, связанным с гепатитом С. Механизмы, с помощью которых диабет может способствовать печеночной энцефалопатии, включают: а) состояния воспаления у пациентов с циррозом связаны с бактериальной транслокацией, печеночной энцефалопатией и риском спонтанного бактериального перитонита. Синдром резистентности к инсулину и сахарный диабет типа 2 считаются воспалительным состоянием из-за увеличения продуцирования провоспалительных цитокинов, таких как TNFα и IL-6 [17]; б) ухудшение моторики было описано у пациентов с диабетом, показывающих задержанное время пролечения двенадцатиперстной кишки. Это может способствовать росту бактериального роста толстой кишки (SIBO), повышающему скорость транслокации бактерий. Действительно, SIBO был обнаружен у более чем 60% пациентов с циррозом, и он был сильно связан с бактериальной транслокацией [18]. Более того, тест на лактулозное дыхание был изменен у 8 из 9 пациентов с предыдущими приступами печеночной энцефалопатии; c) Диабет типа 2, по-видимому, играет роль модуляции нескольких изоформ глутаминазы (GA). Описаны три изоформы глутаминазы; (KGA), печень (LGA) и тип C (CGA). Baglietto-Vargas et al. продемонстрировал, что KGA и LGA присутствуют в эндокринной поджелудочной железе (KGA в альфа-клетках и периферии островков и LGA в бета-клетках) и могут играть определенную роль в секреции инсулина [19]. Кроме того, диабет типа 2 способствует почечному поглощению глютамина в плазме для производства мочевого аммиака, активируя KGA. Кроме того, индуцированные стрептозотоцином диабетические крысы продемонстрировали, что гепатоциты используют глутамин быстрее, чем гепатоциты у нормальных крыс; вследствие этого глутаминазная активность у крыс с диабетом увеличивается, что приводит к более высокому поглощению глютамина и производству аммиака. Кроме того, Watford et al. наблюдали увеличение активности глутаминазы в тонком кишечнике у крыс с диабетом 2 типа [20].

Влияние метформина на печеночную энцефалопатию было сильнее, чем ожидалось. Несмотря на то, что все эти данные подтверждают активное влияние метформина на цирротику, при ретроспективном анализе нельзя исключить смещение выборки. Более того, хотя метформин, по-видимому, более безопасен, чем экзогенный инсулин, предотвращающий осложнения цирроза, может быть трудно поддерживать адекватные уровни глюкозы в крови только сенсибилизаторами инсулина. Таким образом, необходим баланс между контролем глюкозы, чтобы избежать прогрессирования диабета и чувствительности к инсулину, чтобы избежать осложнений цирроза. Другие результаты цирроза, особенно асцит, также были модифицированы при использовании метформина (вероятно, из-за уменьшения воспаления [21]), но по-другому и были нецелесообразны для нашего исследования.

В заключение наши результаты показали, что использование метформина снижает риск развития печеночной энцефалопатии у пациентов с диабетической циррозой, возможно, двумя механизмами: ингибирование активности частично глутаминазы и улучшение чувствительности к инсулину. Рандомизированное контрольное исследование является гарантией подтверждения или отсутствия этих данных, определяющих полезность метформина в лечении цирроза печени.