Методические указания по диагностике кишечных инфекций

РЕКОМЕНДОВАНЫ 25 июля
1978 г., б/н

1.
Общие положения

1.1. Настоящие
Методические указания распространяются на следующие вирусные
респираторно-кишечные инфекции (пневмоэнтериты) крупного рогатого
скота: инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3), вирусную
диарею (ВД), аденовирусную инфекцию (адено),
респираторно-синцитиальную инфекцию (PC), грипп.

1.2. Лабораторная
диагностика вирусных респираторно-кишечных инфекций заключается
в:

—
обнаружении антигена в патологическом материале методами
иммунофлуоресценции (ИФ), реакции связывания комплемента (РСК),
реакции диффузионной преципитации (РДП);

—
выделении возбудителя из патологического материала в культуре
клеток или на куриных эмбрионах и его идентификации в одной из
серологических реакций: РСК, РДП, реакции торможения
гемагглютинации (РТГА), реакции торможения гемадсорбции, (РТГАд),
реакции нейтрализации (РН), реакции торможения непрямой
гемагглютинации (РТНГА), ИФ;

—
выявлении антител в крови больных и переболевших животных
(ретроспективная диагностика) в одной из серологических реакций:
реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), РДП, РН, РТГА, РСК,
реакции нейтрализации вирусных гемагглютининов (РНВГ).

1.3. Схема исследований
при лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных
инфекций крупного рогатого скота (см. стр.209, 210).

1.4. При лабораторной
диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного
рогатого скота используют соответствующие каждой инфекции
диагностические наборы, выпускаемые биологической
промышленностью.

1.5. Диагностика вирусных
пневмоэнтеритов проводится параллельно с исследованием материала на
бактериальные и хламидийную инфекции.

1.6. Лабораторный диагноз
на вирусные респираторно-кишечные инфекции ставится на основании
положительных результатов обнаружения антигена в патологическом
материале с помощью одной из серологических реакций (ИФ, РДП, РСК)
или выделения и идентификации возбудителя в одной из реакций,
указанных в схеме п.1.3, или установления четырехкратного прироста
антител в крови переболевших животных.

Обозначения: ПЭК —
почка эмбриона коров; ПТ — почка телят; ТБ — тестикулы бычков; СЭК
— селезенка эмбриона коров; ЛЭК — легкие эмбриона коров.

Диагноз на вирусные
пневмоэнтериты считают установленным по результатам лабораторного
исследования с учетом эпизоотологических и клинических данных и
патологоанатомических изменений.

1.7. Для постановки
лабораторного диагноза путем обнаружения антигена в патологическом
материале требуется 2…3 дня, с помощью выделения вируса и его
идентификации — до 30 дней, а путем выявления прироста антител в
крови животных — от 2 до 4 недель.

2.
Взятие и подготовка материала для исследования

2.1. В лабораторию для
исследования направляют патологический материал от больных
животных, взятый в период максимального проявления у них
клинических признаков (температурная реакция, угнетение,
воспалительные процессы в верхних дыхательных путях,
сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой
полости, поносы, иногда аборты), или от вынужденно убитых или
павших животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их
гибели.

2.2. От больных животных
берут: 1) тампонами мазки со слизистой носовой полости (при ИРТ —
со слизистой глаз, влагалища, препуция) для реакции
иммунофлуоресценции и для выделения возбудителя; 2) фекалии — для
выделения возбудителя и 3) пробы крови — для выявления в ней титра
антител.

Тампоны с материалом
помещают в пенициллиновые флаконы с 2…5 мл питательной среды для
культуры клеток или раствора Хенкса, содержащие 1000 ЕД/мл
пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина.

Кровь в объеме не менее
5,0 мл берут в пробирки, после свертывания доставляют в
лабораторию.

2.3. От павших и
вынужденно убитых животных берут кусочки носовой перегородки,
трахеи, легких, селезенки, почки, средостенные и брыжеечные
лимфатические узлы и при поносах — кусочки тонкого отдела
кишечника. От абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных
органов, околоплодную жидкость.

2.4. Флаконы с
патологическим материалом доставляют в лабораторию в термосе со
льдом.

2.5. В лаборатории
флаконы с тампонами встряхивают 2…3 мин, тампоны отжимают и
удаляют, а содержимое флакона центрифугируют при 2 тыс. об/мин в
течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную
пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл
стрептомицина, выдерживают при 4°С в течение 2…4 ч и используют
для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов. Из осадка
центрифугата готовят мазки для исследования методом
иммунофлуоресценции.

2.6. Флаконы с фекалиями
замораживают при температуре -20°С (в морозилке холодильника) в
течение 18 ч, после чего оттаивают при 37°С и центрифугируют при 5
тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в
стерильную пробирку, вносят 1000 ЕД/мл пенициллина, 1000 мкг/мл
стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина, выдерживают при 4°С в течение
2…4 ч, дополнительно центрифугируют и используют для заражения
культуры клеток или куриных эмбрионов.

2.7. Со слизистой носовой
перегородки, трахеи, влагалища, бронхов и кишечника делают
скальпелем соскобы, вносят их в центрифужную пробирку с 5 мл
физиологического раствора и центрифугируют при 2 тыс. об/мин в
течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в 0,5 мл того же
раствора и готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах для
исследования методом иммунофлуоресценции.

Из кусочков легкого и
лимфатических узлов готовят отпечатки на предметных стеклах или
срезы толщиной 5 микрон для исследования тем же методом.

2.8. Из кусочков органов
готовят 10…20%-ную суспензию для выделения возбудителя и
приготовления комплементсвязывающего и преципитирующего
антигенов.

2.9. Для получения
суспензии (с целью выделения вируса) ткань измельчают, растирают в
ступке со стеклянным песком, разводят раствором Хенкса, содержащим
антибиотики, центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин.
Надосадочную жидкость отсасывают, выдерживают при температуре 4°С в
течение 2…4 ч и используют для заражения культуры клеток или
куриных эмбрионов.

2.10. Для изготовления
испытуемого комплементсвязывающего антигена ткань измельчают в
ступке или специальном микроизмельчителе, разводят 1:5 содержащим
антибиотики физиологическим раствором, рН 7,2…7,4. Полученную
20%-ную суспензию замораживают при температуре -20°С в течение
16…18 ч, быстро оттаивают при температуре 37°С, повторно
растирают или гомогенизируют, а затем центрифугируют при 5 тыс.
об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и далее
используют, как указано в п.5.1.

3.
Обнаружение вирусных антигенов в патологическом материале методом
иммунофлуоресценции

3.1. Метод
иммунофлуоресценции для обнаружения вируса применяется при
диагностике всех респираторно-кишечных инфекций, указанных в
п.1.1.

3.2. Полученные мазки,
отпечатки и срезы подсушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в
течение 5 мин и окрашивают флуоресцирующими сыворотками, имеющимися
в наборах диагностикумов. Каждой сывороткой окрашивают по 4
препарата из каждого органа.

3.3. Окрашивание
препаратов ведут во влажной камере при температуре 37°С в течение
45 мин. Затем препараты споласкивают в трех сменах физиологического
раствора, рН 7,2…7,4, и в дистиллированной воде, подсушивают на
воздухе. На препараты наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют
их под люминесцентным микроскопом.

3.4. Для контроля
специфичности свечения ставят реакцию подавления
иммунофлуоресценции. Для этого на два препарата из органа, при
исследовании которого получена положительная реакция
иммунофлуоресценции, наносят соответствующую выявленному вирусу
сыворотку в разведении 1:10 и выдерживают их в термостате во
влажной камере в течение 30 мин.

Препараты споласкивают в
трех сменах физиологического раствора, рН 7,2…7,4, и окрашивают
флуоресцирующей сывороткой.

3.5. Учет реакции.
Положительным результатом исследования методом ИФ считается наличие
специфической флуоресценции, которая характеризуется тем, что в
препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой, ткань
флуоресцирует тусклым зеленовато-серым цветом, а вирусный антиген
при этом выявляется в виде ярких зеленовато-желтых различных по
величине гранул или в виде диффузного свечения в цитоплазме или
(при ИРТ, адено) в ядре.

В
контрольных препаратах, обработанных последовательно специфической
и флуоресцирующей сыворотками, специфическая флуоресценция должна
отсутствовать.

Диагноз на вирусную
респираторно-кишечную инфекцию ставят при обнаружении специфической
флуоресценции не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом
из них 3…5 и более флуоресцирующих клеток или при наличии
15…20% флуоресцирующих клеток при подсчете не менее 100 клеток в
препарате. При выявлении меньшего числа флуоресцирующих клеток
диагноз подтверждают исследованием антител в парных пробах
сывороток крови больных животных или выделением возбудителя.

3.6. При исследовании
материала от животных, привитых живыми вакцинами против инфекций,
на которые проводятся диагностические исследования, положительные
результаты ИФ во всех случаях следует подтверждать исследованием
парных проб сывороток крови.

4.
Обнаружение антигена вируса ИРТ в РДП

4.1. РДП ставят в
агаровом геле.

4.2. Компоненты реакции:
специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная
сыворотка; исследуемый материал от больных животных; специфический
антиген.

4.3. Агаровую среду
готовят по прописи: агар — 1,0, физиологический раствор рН 7,4 —
100,0 мл. Агар расплавляют на водяной бане и разливают в чашки
Петри по 25 мл или на обезжиренные предметные стекла. В слое
застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки — одну
центральную и 6 вокруг нее на расстоянии 0,5…0,7 см.

4.4. Постановка реакции.
В центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в лунки по
окружности — испытуемый материал. Параллельно испытуемый материал
исследуют с отрицательной сывороткой.

Контроли:

1) контрольный
положительный антиген + специфическая сыворотка;

2) контрольный
положительный антиген + отрицательная сыворотка.

Чашки Петри или
предметные стекла помещают во влажную камеру, выдерживают при
температуре 37°С в течение 18…24 ч и затем при комнатной
температуре в течение такого же времени.

4.5. Учет реакции.
Реакцию считают положительной при условии образования ясно
выраженной линии преципитации между лунками с исследуемым антигеном
и специфической сывороткой, а также между контрольным положительным
антигеном и специфической сывороткой при отрицательном результате с
отрицательной сывороткой.

5.
Обнаружение антигена адено в патологическом материале в РСК

5.1.
Комплементсвязывающий антиген готовят из 20%-ной суспензии
патологического материала, обработанной, как указано в п.2.10. Для
этого к ней добавляют 1%-ный раствор гексаметафосфата натрия до
конечной концентрации 0,05% и раствор 1 н. НСl для снижения рН до
4,1.

Смесь оставляют на 30
мин, а затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин.
Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в 1/20
первоначального объема суспензии 0,1 М (моль/л) фосфатно-буферного
раствора, рН 7,9, содержащего 0,85% хлористого натрия. Полученный
раствор осветляют центрифугированием при том же режиме и исследуют
в РСК с иммунными сыворотками к аденовирусу крупного рогатого
скота.

5.2. Компоненты реакции:
испытуемый антиген; два стандартных специфических антигена,
относящиеся к двум антигенным подгруппам; отрицательный антиген;
две специфических сыворотки, соответствующие антигенным подгруппам;
нормальная сыворотка.

5.3. Испытуемый антиген
исследуют в двукратных разведениях, остальные антигены и сыворотки
— в удвоенном титре.

5.4. Постановка реакции.
Реакцию ставят в пробирках в объеме 0,5 мл или используют
микротитратор Такачи. РСК проводят в три этапа: титрование
комплемента в чистом виде, титрование комплемента в присутствии
антигенов и сывороток, главный опыт.

5.5. Для титрования
комплемента во вспомогательном ряду пробирок готовят различные дозы
по следующей схеме:

Комплемент титруют по следующей схеме: