Методы исследования при вирусном гепатите

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела.

Метод обнаружения с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого .

В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, соответствующих применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых.

Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой вначале заболевания (3-7 день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и более повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (JgM и JgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.

При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентом в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М (JgM). Лишь позднее, на 8-12-й день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G (JgG). При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (JgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеинов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется.

Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, т. е. одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например вирус гепатита С.

ПЦР — это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:
• возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в том числе и в материале, получаемом при биопсии;
• возможна диагностика инфекционных болезней на самых разных стадиях заболевания;
• возможность количественной оценки результатов исследований ( сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
• высокая чувствительность метода.

Исследования вирусов гепатита

В настоящее время выделяют следующие формы вирусных гепатитов: гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, гепатит G и гепатит ТТ. Для диагностики каждой из перечисленных форм вирусных гепатитов используется определенный перечень маркеров.

Вирусный гепатит А

Гепатит А — острая энтеровирусная инфекция. Возбудитель — вирус гепатита А (ВГА,HAV) — энтеровирус типа 72. Геном вируса представлен однонитчатой РНК. Вирус гепатита А содержит единственный антиген (HA-Ag). Удельный вес гепатита А в суммарной заболеваемости вирусными гепатитами составляет 70-80%. В структуре заболеваемости гепатитом А дети составляют до 80%, причем основная масса — дошкольники и школьники начальных классов.

ИФА и ПЦР исследования при гепатите А

Вирусный гепатит В

Гепатит В – вирусная антропонозная инфекция. Возбудитель вирус гепатита В (ВГВ, HBV) – относится к семейству гепаднавирусов, ДНК-содержащих вирусов, поражающих клетки печени. Вирионы ВГВ имеют наружную липопротеидную оболочку и нуклеокапсид, содержащий двунитчатую ДНК и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу.

В структуре ВГВ (HBV) выделяют следующие антигенные системы:
• поверхностный («австралийский») антиген, HBsAg, находящийся в составе липопротеидной оболочки ВГВ, является маркером ВГВ, указывая на инфицированность вирусом;
• ядерный (core), HBcAg – обнаруживается в составе нуклеокапсида вирионов, свидетельствует об активной репродукции вируса;
• HBeAg – входит в состав ядра ВГВ, указывая на активность вируса и, кроме того, на его высокую вирулентность и инфицированность;
• HBxAg – расположен вблизи оболочки вириона, его роль в генезе инфекции изучается.

В диагностике вирусного гепатита В ведущее значение имеет определение комплекса маркеров гепатита. Свыше 5% населения планеты охвачено этой инфекцией, а частота безжелтушных форм ВГВ составляет, по данным разных авторов, от 60 до 82%.

ИФА и ПЦР исследования при диагностике вируса гепатита В

Вирус гепатита С, генотипы

Гепатит С (ВГС) – вирусное заболевание, наиболее часто протекающее в виде посттрансфузионного гепатита с преобладанием безжелтушных и легких форм и склонное к хронизации процесса.

Возбудитель — вирус гепатита С – имеет сходство с флавовирусами, содержит РНК. На основе филогенетического анализа выделено 6 генотипов ВГС и более 80 субтипов.

Генотип 1 — наиболее распространенный генотип во всем мире (от 40 до 80%). Генотип 1а является доминирующим для США, а 1b преобладает в Западной Европе и Южной Азии.

Генотип 2 распространен во всем мире, однако встречается с меньшей частотой, чем генотип 1 (от 10 до 40%).

ВГС тип 3 характерен для Индии, Пакистана, Австралии и Шотландии. Генотип 4 распространен преимущественно в Средней Азии и Египте, генотип 5 – в Южной Африке, а генотип 6 – в Гонконге и Мокао.

Примерно 90% всех случаев посттрансфузионных гепатитов связано с ВГС. Среди доноров антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) обнаруживают в 0,2-5% случаев.

У 40-75% пациентов регистрируется бессимптомная форма болезни, у 50-75% больных острым ВГС формируется хронический гепатит, у 20% из них развивается цирроз печени. Важная роль ВГС отводится и в этиологии гепатоклеточной карциномы.

Геном вируса гепатита С представлен одноцепочечной положительно заряженной РНК, которая кодирует 3 структурных и 5 неструктурных белков. К каждому из этих белков вырабатываются антитела, обнаруживаемые в крови больных гепатитом С.

Отличительной чертой ВГС является волнообразное течение заболевания, в котором разграничивают 3 фазы: острую, латентную и фазу реактивации.
Для острой фазы характерно повышение активности печеночных ферментов в сыворотке крови, уровня антител класса IgM и IgG к ВГС с нарастанием титров, а также РНК ВГС.

Латентная фаза характеризуется отсутствием клинических проявлений, наличием в крови антител класса IgG к ВГС в высоких титрах, отсутствием антител класса IgM и РНК ВГС либо их присутствием в низких концентрациях на фоне незначительного повышения активности печеночных ферментов в периоды обострения.
Для фазы реактивации характерно появление клинических признаков, повышение активности печеночных ферментов, наличие антител класса IgG (к нуклеокапсидному белку core и неструктурным белкам NS) в высоких титрах, присутствие РНК ВГС и нарастание титров антител класса IgM к ВГС в динамике.

ИФА и ПЦР исследования на вирус гепатита С, определение генотипа

Вирусный гепатит D

Гепатит D – вирусная инфекция, вследствие биологических особенностей вируса протекающая исключительно в виде ко- или суперифекции при гепатите В, характеризующаяся тяжелым течением,
часто неблагоприятным исходом.

Самостоятельно, без вируса В, вирус гепатита D не может попасть в организм человека

Возбудитель – вирус гепатита D (ВГD), по своим биологическим свойствам приближается к вироидам – обнаруженным молекулам нуклеиновых кислот. Печень человека – единственное место размножения (репликации) ВГD.

Известно существование двух вариантов инфекции: коинфекция (одновременное заражение ВГВ и ВГD) и суперинфекция (заражение HBsAg-позитивных пациентов). Сочетание ВГВ и ВГD сопровождается развитием более тяжелых форм патологического процесса, что определяется главным образом действием ВГD.

Летальность при суперинфекции достигает 15-20%. Инфицирование дельта-вирусом может вызывать острое заболевание, заканчивающееся выздоровлением, или формировать хроническое носительство ВГD.

При гепатите D могут отсутствовать в крови маркеры гепатита В – анти НВс и НВs-антиген – и наблюдается угнетение ДНК-полимеразной активности, так как ВГD ингибирует репликацию вируса гепатита В.

ИФА и ПЦР исследования на вирус гепатита D

Диагностика гепатита С включает сбор анамнеза, лабораторные пробы, а также инструментальные обследования печени. УЗИ проводится для оценки степени поражения органа и выявления сопутствующих отклонений – онкологии, фиброза. Без этих методов невозможно выявить болезнь, поскольку даже острая форма вирусного воспаления печени из-за HCV (С-гепатита) протекает со смазанными симптомами. Желтизна кожи, изменения в цвете мочи и кала, боль в правом подреберье и другие симптомы возникают при хронизации гепатита.

Особенности диагностики гепатита С

Инкубационный период гепатита С составляет от 4 недель до 6 месяцев. Чаще всего симптомы болезни возникают через 3 месяца после заражения. Человек жалуется на тошноту и рвоту, слабость, ощущение разбитости, но чаще всего не обращается к врачу, принимая эти признаки за ОРВИ или отравление. Диагностика вирусного гепатита по анамнезу на этом этапе невозможна.

Если же обращение к специалисту произошло, и он заподозрил болезнь, человека направят сдать общие анализы крови, мочи. В них будет показан увеличенный уровень лейкоцитов, в моче обнаружится белок. При дальнейшей диагностике в процессе биохимического исследования устанавливается поражение печени. С-гепатит выявляется дифференциальными методами в лабораторных условиях – кровь исследуют на частицы вируса и антител.

После установки диагноза назначают лечение, одновременно с этим оценивая состояние печени инструментальными методами. На этом этапе необходимо сразу же начинать лечение, чтобы не произошло хронизации процесса.

Лабораторная диагностика

Биохимический анализ крови выполняется на высокоточном оборудовании с низкой вероятностью ошибки. В крови ищут частички вируса и антитела к нему, а также берут печеночные пробы с целью определить, насколько сильно поражена печень. Важно грамотно подготовиться к сдаче анализа:

1. Исключить алкоголь, курение, наркотики за 3 дня до забора материала.
2. Не принимать лекарства – они искажают результаты теста, особенно если это противовирусные препараты.
3. Сдавать кровь на анализ, будучи здоровым – вне фазы обострения хронических вирусных инфекций, а также через 2 недели после выздоровления от ОРВИ и других вирусных или бактериальных патологий.

Если вы принимаете лекарства, прием которых не может быть отменен, об их употреблении нужно предупредить врача в лаборатории. Нельзя скрывать и такие состояния, как беременность, поскольку в этот период из-за гормональных скачков результаты также будут искажены.

ИФА

По результатам данных иммуноферментного анализа предполагают хронический либо острый вирусный гепатит С. Точный диагноз зависит от набора антител, они же определяют стадию болезни:

1. Анти HCV-IgG – антитела к вирусной РНК, которые определяются в крови у заболевших людей, если с момента заражения прошло около 4 недель, у больных в активной фазе, а также у находящихся в состоянии выздоровления после острой формы и в ремиссии хронической. У выздоровевших пациентов также остаются антитела IgG, после лечения их присутствие в крови на фоне отрицательных результатов ПЦР-диагностики на частички вируса – показатель выздоровления.
2. Анти HCV-IgM. Эти иммуноглобулины вырабатываются при обострениях хронического гепатита или острой форме болезни, свидетельствуют об активном размножении вируса. Антитела IgM – показатель, что человек болен гепатитом С в активной фазе.
3. Антитела к специфическим белковым фрагментам вирусного ядра. Их ищут не только в крови, но и в тканях печени. Положительный результат маркеров анти-HCV IgG NS4, анти-HCV IgG NS5 – признак длительной хронической болезни в стадии ремиссии. Появление IgM-маркеров к HCV-NS4 и HCV-NS5 – признак рецидива хронического процесса.

Результаты иммуноферментной диагностики подтверждают наличие антител, но не самого вируса. В редких случаях антитела IgG присутствуют у людей, которые переболели гепатитом С и выздоровели самостоятельно, даже не подозревая об этом.

ПЦР

Полимеразно-цепная реакция – лабораторный метод диагностики, основанный на поиске частичек вируса гепатита в крови больного. После забора материала из вены проводят диагностические мероприятия:

• Качественный тест – определяет наличие либо отсутствие вируса в крови.
• Количественная диагностика. В зависимости от уровня вирусной нагрузки делают выводы о прогрессе болезни и ее стадии, а также определяют длительность терапии. На лечение при низкой вирусной нагрузке (меньше 180 тыс. МЕ/мл) уйдет меньше времени, чем при высокой (до 25 млн. МЕ/мл).
• Генотипирование. Вирус С-гепатита постоянно мутирует, из-за этого невозможно изобрести вакцину к нему. Генотипы отличаются по тяжести протекания болезни, риску осложнений (фиброза, рака), а также устойчивости к противовирусной терапии. При генотипе 3, например, неэффективна стандартная схема Интерферон-Рибавирин, применяют Даклатасвир, Софосбувир, Ледипасвир в различных комбинациях.

Чаще всего диагностика по определению генотипа проводится в качестве дополнительной меры, когда у человека обнаруживают резистентность (невосприимчивость) к терапии.

При невозможности сделать этот тест сразу по направлению врача, лучше пройти диагностику в частном порядке, чтобы не терять время в случае резистентности.

Печеночные пробы

При разрушении клеток печени в кровь высвобождается большое количество АЛТ и АСТ – ферментов, которые в норме можно обнаружить только в печеночных тканях. При гепатите анализы показывают высокий уровень АЛТ и АСТ в крови, по нему определяют активность воспаления:

1. Минимальная – ферменты в 3 и менее раз выше нормы.
2. Умеренная – уровень больше нормы в 3-10 раз.
3. Высокая – печеночные ферменты обнаруживаются в количестве, превышающем норму в 11 и более раз.

Диагностика на печеночные ферменты не позволяет отличить острый гепатит (ОВГС) от хронической формы болезни.

Методы аппаратной диагностики

Инструментальная диагностика не выявляет причины, спровоцировавшей разрушение печени, но определяет состояние органа. Такая диагностика применяется для оценки здоровья железы, своевременного обнаружения рубцов и онкологических осложнений гепатита С.

УЗИ

При гепатите печень увеличена, а воспаленные участки обладают другой эхогенностью. Ультразвуковую диагностику назначают при первом обращении в стационар за диагнозом, а также после окончания терапии для отслеживания прогресса восстановления.

Эластометрия

На это обследование направляют пациентов с фиброзом, развившимся на фоне хронического гепатита. Фиброз и цирроз – это замена уничтоженных клеток печени рубцовой тканью. Процесс приводит к утрате органом своих функций, и обратим только на ранних стадиях. Эластометрия – оценка эластичности тканей печени. Пораженные фиброзом участки обладают другой эхогенностью, поэтому рубцы будут видны при ультразвуковой диагностике.

Биопсия печени

Дифференциальная диагностика гепатита лабораторными методами выявляет вирусное воспаление печени. Но с помощью лабораторных методов диагностики не получится обнаружить рак или кисту. Сделать это можно, если разглядеть на УЗИ новообразование, а затем провести забор нескольких клеток на обследование тонкой иглой. От сроков проведения биопсии зависит своевременность хирургического вмешательства по удалению опухоли.

Из-за высокого риска рака людям с гепатитом показано ультразвуковое обследование печени с проверкой всех появившихся новообразований на онкогенность.

Экспресс-тестирование

В связи с нарастающей эпидемией ВИЧ, гепатита и других социально-опасных болезней, многие инфекционные центры предлагают возможность быстрого прохождения анализов крови на эти болезни. Преимущество экспресс-теста:

• Ранняя диагностика гепатита при заражении (4+ недель после инфицирования).

• Можно пройти обследование анонимно.

В аптеке можно купить также наборы для домашнего тестирования. Для диагностики нужна слюна или кровь. Материал наносят на тест-полоску, ждут указанное в инструкции время, а затем сравнивают с приложенным шаблоном.

Из недостатков экспресс-методов диагностики выделяется их ненадежность, если человек болеет другими вирусными инфекциями – гепатитами иных типов, герпесом, ВПЧ, ВИЧ и т.д.

Чтобы вовремя обнаружить гепатит C, достаточно делать биохимический анализ крови дважды в год. При гепатите результаты этого обследования насторожат врача высокими показателями печеночных проб. После дополнительных анализов будет выставлен диагноз и назначена терапия. При острой форме болезни на выздоровление уйдет от 2-3 месяцев до полугода.