Моделирование цирроза печени на лабораторных животных

Изобретение относится к экспериментальной медицине и фармакологии, может быть использовано для изучения токсических поражений печени, в доклиническом исследовании гепатозащитных препаратов и в разработке новых способов лечения данной патологии.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению является способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих (см. а. с. 94026117, G 09 В 23/28, БИ 24, 1996), где в качестве химического вещества берут формалин и вводят его путем вдыхания воздуха, содержащего 17,5-18,5 мг/л формалина.

Известный способ моделирования цирроза печени является продолжительным и трудоемким: ежедневные ингаляционные опыты в течение 7 месяцев. Кроме того, 70%-ный раствор формалина представляет собой водный раствор формальдегида, который обладает резко выраженным раздражающим и сенсибилизирующим действием, средняя смертельная концентрация для крыс 588 мг/м3. Предельно допустимая концентрация паров формальдегида в воздухе рабочей зоны 0,5 мг/м3, 2 класс опасности. Вещество остронаправленного механизма действия, способное вызывать аллергические заболевания в условиях производства и требующее автоматического контроля за его содержанием в воздухе.

При концентрации формалина 17,5-18,5 мг/л (или 17500-18500 мг/м3) возможно развитие острого отравления всего организма с воспалительными и некробиотическими изменениями слизистых оболочек верхних дыхательных путей и легких.

В условиях производства хроническое воздействие высоких концентраций формалина недопустимо.

Техническим результатом изобретения является повышение воспроизводимости и упрощение способа, сокращение сроков моделирования цирроза печени и приближение к клиническому течению данной патологии печени.

Технический результат достигается тем, что в желудок лабораторного животного 2 раза в неделю в течение месяца вводят 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и ежедневно в течение месяца вместо воды для питья дают 10%-ный раствор этанола.

Для определения кратности введения 50%-ного раствора совтола-1 на оливковом масле и его количества для моделирования цирроза печени был проведен эксперимент на животных, полученные данные сведены в табл. 1.

Одновременно в течение всего эксперимента животным давали вместо воды 10%-ный раствор этанола.

Из таблицы 1 видно, что при кратности введения 50%-ного раствора совтола-1 на оливковом масле два раза в неделю воспроизводится надежная модель цирроза печени без гибели животных.

Повышение воспроизводимости формирования хронического патологического процесса в печени и сокращения сроков опыта достигается при использовании совтола-1 и 10%-ного этанола в качестве питья вместо воды, за счет потенцирования гепатотоксического эффекта. Экспериментальный цирроз печени подтвержден морфогистохимическими и биохимическими показателями.

Способ моделирования цирроза печени осуществляется следующим образом.

Лабораторному животному два раза в неделю в течение месяца вводят в желудок зондом 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела.

На протяжении всего эксперимента ежедневно для питья дают 10%-ный раствор этанола.

Готовят: 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 1 часть совтола-1 и 2 части оливкового масла, перемешивают и вводят в желудок зондом, а 10%-ный раствор этанола для питья готовят путем разведения 96o этилового спирта.

ПРИМЕР . Крысе, 180 г, 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле вводился из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела дважды в неделю в течение одного месяца, на протяжении эксперимента для питья животному давали 10%-ный раствор этанола.

В течение всего опыта не отмечено каких-либо изменений внешнего вида и поведения животного, кроме частичного отказа от пищи.

По истечении одного месяца проведена декапитация животного. Морфогистохимический анализ кусочков печени показал развитие хронического патологического процесса, основным проявлением которого является цирроз печени.

Это подтверждается увеличением относительной массы печени и развитием в печеночной паренхиме фиброза и цитолиза. На гистологических препаратах печени поля фиброза занимают 3,1% среза, у интактной крысы на долю соединительной ткани приходится 0,5%. Гепатоциты локализованы преимущественно в перипортальной зоне, находятся в состоянии белковой и жировой дистрофии. Определяется дискомплектация печеночных балок, пролиферация соединительной ткани в портальных трактах с проникновением фиброзных тяжей в глубь долек. В поле зрения большое количество некротизированных гепатоцитов, отек и разрыхление стремы, в клеточном инфильтрате наблюдаются лимфоциты.

При морфометрии препаратов печени выявлено снижение ядерноцитоплазматического отношения, отклонения стромы к паренхиме (см. табл.2).

Гистохимический анализ ткани печени показал увеличение активности кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы и снижение активности АТФазы.

Экспериментальный цирроз печени подтверждается также изменениями биохимических показателей: увеличением содержания изолированных двойных связей, диеновых коньюгатов, триеновых конъюгатов, глюкозоаминогликанов в ткани печени (см. табл.3).

Кроме того, наблюдается увеличение количества оксипролина во фракциях коллагена кислоторастворимого и кислотоустойчивого.

В сыворотке крови выявлено повышение активности ферментов: аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы.

Предлагаемым способом воспроизводится надежная модель цирроза печени, что подтверждено морфогистохимическим анализом печени и биохимическими показателями. Модель позволяет изучать тяжелый хронический процесс в печени в динамике его развития.

Предлагаемый способ моделирования цирроза печени в сравнении с известным (см. табл. 4) позволяет повысить воспроизводимость моделирования при сокращенных сроках опыта и в более упрощенном виде приблизиться к клиническому течению цирроза печени вследствие развития необратимых структурных и функциональных изменений в гепатоцитах, что подтверждено морфогистохимическим анализом, биохимическими показателями и оценкой поведения животных.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ моделирования цирроза печени путем введения химических веществ лабораторному животному, отличающийся тем, что в желудок вводят два раза в неделю в течение месяца 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и 10%-ный раствор этанола вместо воды для питья.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для моделирования цирроза печени с синдромом портальной гипертензии. Для этого выполняют эмболизацию ветвей воротной вены экспериментальных животных путем катетеризации брыжеечной или селезеночной вены по Сельдингеру с селективной катетеризацией портальной вены печени с применением гемостатической губки. Дополнительно проводят сужение полой вены проксимальнее впадения печеночных вен с обтурацией устьев печеночных вен. После этого подкожно вводят 40% раствор четыреххлористого углерода в подсолнечном масле из расчета 2,0 мл/кг два раза в неделю. Способ обеспечивает сокращение времени моделирования, повышение воспроизводимости цирроза печени с синдромом портальной гипертензии, а также обеспечивает возможность изучения механизмов возникновения заболевания.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть применено для получения модели цирроза печени с синдромом портальной гипертензии.

Лечение осложнений портальной гипертензии, обусловленной циррозом печени, остается актуальной проблемой хирургической гепатологии. Наиболее фатальным осложнением цирроза печени является кровотечение из варикозно расширенных вен пищевода и кардии, ведущим фактором в патогенезе развития кровотечений при этом является высокое портальное давление (Котив Б.Н. Хирургическая профилактика и лечение пищеводно-желудочных кровотечений при портальной гипертензии: дис. … докт. мед. наук. — Санкт-Петербург, 1998. — 232 с.).

Для повышения эффективности лечения больных циррозом печени необходимо решение ряда задач в опытах на животных путем создания модели заболевания.

Моделирование цирроза печени с синдромом портальной гипертензии является достаточно сложной задачей, обусловленной многообразием функций печени и особенностями ее васкуляризации, представленной двумя самостоятельными системами — воротной веной и печеночной артерией.

Известен способ моделирования цирроза печени путем длительного введения малых доз гепатотропного яда в виде четыреххлористого углерода (CCl4). При вскармливании собак 2 раза в неделю с пищей по 3-5 мл раствора CCl4 цирроз развивается спустя 6 месяцев (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени. — Будапешт: Изд-во АН Венгрии, 1961. — 215 с.).

Портальную гипертензию, вызванную внутрипеченочным блоком, воспроизвести труднее всего. Она может возникнуть у животных с выраженным некрозом печени, особенно развившимся на фоне центролобулярного некроза. В этих условиях воспроизводимость портальной гипертензии невелика и не превышает 30-40%, следовательно, результаты опыта практически непрогнозируемы.

Известен способ моделирования цирроза печени по методике Д.С. Саркисова (Руководство по экспериментальной хирургии / С.А. Шалимов, А.П. Радзиховский, Л.В. Кейсевич. — М.: Медицина, 1989. — 272 с.). По методике Д.С. Саркисова (1965) моделирование цирроза печени проводилось введением подопытным кроликам 40% раствора четыреххлористого углерода в персиковом масле из расчета 2,0 мл/кг два раза в неделю. При этом процесс формирования цирроза печени начинается через 1,5-2 мес от начала эксперимента с отчетливым выражением патологического процесса спустя 3-4 месяца.

Прототипом изобретения является способ моделирования цирроза печени по методике С.А. Шалимова с соавт. (1989) путем селективной катетеризации внутрипеченочных разветвлений воротной вены и их эмболизации микросферами, заключающийся в эндоваскулярной окклюзии воротной вены с введением спирали Гиантурко. Воспроизводимость патологического процесса в данном случае тоже невысока и составляет 50-55% (Руководство по экспериментальной хирургии / С.А. Шалимов, А.П. Радзиховский, Л.В. Кейсевич. — М.: Медицина, 1989. — 272 с.).

Однако проведение моделирования цирроза печени с синдромом портальной гипертензии вышеназванными методиками вызывает трудности, связанные с необходимостью длительного эксперимента, с применением дорогостоящих инвазивных ангиографических и эндоваскулярных вмешательств.

Задачей изобретения является разработка способа ускоренного моделирования цирроза печени с синдромом портальной гипертензии.

Технический результат — сокращение времени моделирования и повышение воспроизводимости цирроза печени с синдромом портальной гипертензии, возможность изучения механизмов возникновения заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе моделирования цирроза печени с синдромом портальной гипертензии, включающем эмболизацию ветвей воротной вены экспериментальных животных, согласно изобретению эмболизацию ветвей воротной вены проводят путем катетеризации брыжеечной или селезеночной вены по Сельдингеру с селективной катетеризацией ветвей портальной вены печени с применением гемостатической губки, дополнительно проводят сужение полой вены проксимальнее впадения печеночных вен с обтурацией устьев печеночных вен, после чего подкожно вводят 40% раствор четыреххлористого углерода в подсолнечном масле из расчета 2,0 мл/кг два раза в неделю.

Предлагаемый способ моделирования цирроза печени с синдромом портальной гипертензии осуществляют следующим образом. У экспериментального животного проводят хирургическое вмешательство под внутривенным наркозом с применением: рамитар 0,15 мл/кг, пропофол 13,5 мг/кг, при необходимости добавляют стадол, с предварительной премедикацией путем внутримышечного введения коктейля следующего состава: анальгин 50-70 мг/кг (2 мл 50% раствора), димедрол 1,5 мг/кг (0,15 мл 1% раствора), дроперидол 0,5 мг/кг (0,2 мл 0,25% раствора) и 0,01-0,03 мг/кг сульфата атропина (1-2 мл 0,1% раствора).

Проводят эмболизацию ветвей воротной вены путем катетеризации брыжеечной или селезеночной вены по Сельдингеру катетером Cobra 5F под рентгенконтролем с селективной катетеризацией ветвей портальной вены печени экспериментальных животных. При этом продвижение катетера в воротную вену до нужного уровня проводят визуально и пальпаторно. Для эмболизации ветвей портальной вены применяют гемостатическую губку.

Одновременно проводят сужение полой вены проксимальнее впадения печеночных вен с обтурацией устьев печеночных вен в сочетании с подкожным введением 40% раствора четыреххлористого углерода в подсолнечном масле из расчета 2,0 мл/кг два раза в неделю. При проведении эмболизации явления наступившей эмболизации ветвей портальной вены были отмечены уже во время операции.

В результате проведенных исследований получена экспериментальная модель цирроза печени с синдромом портальной гипертензии по ускоренной методике с расширением брыжеечных вен и развитием асцита.

До начала экспериментов и после формирования цирроза печени с развитием портальной гипертензии измеряли давление в воротной вене и выполняли трепанобиопсию печени.

После экспериментального моделирования цирроза печени нами каждые 3-5 сутки в течение 1 месяца производилась трепанобиопсия печени экспериментальных животных под контролем УЗИ при помощи трепана диаметром иглы G-18. Всего было проведено по 4 биопсии у всех экспериментальных животных, с каждого полученного биоптата готовились по 3 среза с разных участков. Анализированы 144 гистологических материала, где у 95,6% экспериментальных животных вышеописанной серии на 17-21 сутки верифицированы изменения, характерные для центролобулярного некроза печени с переходом в цирроз.

Следовательно, при эмболизации ветвей воротной вены в сочетании с перевязкой печеночных вен и дополнительном введении четыреххлористого углерода получена ускоренная модель формирования цирроза печени с явлениями портальной гипертензии, асцитом, расширением брыжеечных вен, где развитие процесса отмечено к началу 3 недели эксперимента.

Давление в воротной вене до начала моделирования цирроза печени варьировало в пределах 91,4±14,2 мм вод.ст. С моделью хронической внутрипеченочной портальной гипертензии этот показатель составил 269,3±17,8 мм вод.ст.

Предлагаемая методика не представляет технических трудностей, и проведенные исследования доказали возможность моделирования цирроза печени в эксперименте по ускоренной методике путем эмболизации ветвей воротной вены в комбинации с дополнительной перевязкой печеночных вен и введением четыреххлористого углерода. Таким образом, уже к началу 3 недели — на 17-21 сутки — сформировывался центролобулярный некроз с переходом в цирроз с повышением давления в воротной вене с 91,4±14,2 до 269,3±17,8 мм вод.ст.

Исследования данным способом выполнены у 38 беспородных собак обоего пола весом 15-35 кг, и получена экспериментальная модель цирроза печени с синдромом портальной гипертензии.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности способа моделирования цирроза печени с синдромом портальной гипертензии, включающего эмболизацию ветвей воротной вены гемостатической губкой в комбинации с дополнительной перевязкой печеночных вен и введением четыреххлористого углерода. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Исследованиями авторов доказано, что моделирование цирроза печени путем эмболизации ветвей воротной вены гемостатической губкой в комбинации с дополнительной перевязкой печеночных вен и введением четыреххлористого углерода сокращает время формирования модели, обеспечивает высокую воспроизводимость цирроза печени с синдромом портальной гипертензии, изучение механизмов возникновения заболевания. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Пример 1. Собака, кобель, вес 18 кг. После стандартной подготовки животного к операции проводили премедикацию внутримышечным введением коктейля следующего состава: анальгин 70 мг/кг (2 мл 50% раствора), димедрол 1,5 мг/кг (0,15 мл 1% раствора), дроперидол 0,5 мг/кг (0,2 мл 0,25% раствора) и 0,03 мг/кг сульфата атропина (2 мл 0,1% раствора). После трехкратной обработки операционного поля 3% настойкой йода произведена срединная лапаротомия. Хирургическое вмешательство проводили под внутривенным наркозом с применением: рамитар 0,15 мл/кг, пропофол 13,5 мг/кг с добавлением стадола. Проводили визуальную оценку состояния органов брюшной полости. Затем под рентгенконтролем выполнили селективную катетеризацию брыжеечной вены по Сельдингеру катетером Cobra 5F с эмболизацией ветвей портальной вены с применением нарезанных кусочков гемостатической губки. Одновременно проводили сужение полой вены проксимальнее впадения печеночных вен с обтурацией устьев печеночных вен в сочетании с подкожным введением 40% раствора четыреххлористого углерода в подсолнечном масле из расчета 2,0 мл/кг два раза в неделю. При проведении эмболизации интраоперационно отмечены явления наступившей эмболизации ветвей портальной вены.

После экспериментального моделирования цирроза печени каждые 3-5 сутки в течение 1 месяца производилась трепанобиопсия печени экспериментального животного под контролем УЗИ при помощи трепана диаметром иглы G-18. Всего было проведено по 4 биопсии, с каждого полученного биоптата готовились по 3 среза с разных участков. При этом в биоптате, выполненном на 18 сутки, верифицированы изменения, характерные для центролобулярного некроза печени с переходом в цирроз. Во время канюляции брыжеечной вены и после формирования цирроза печени с развитием портальной гипертензии измеряли давление в воротной вене, что составило от 97,2 до 283,4 мм вод.ст. соответственно.

В послеоперационном периоде также отмечено ухудшение показателей печеночного обмена в биохимических анализах крови.

Пример 2. Собака, сука, вес 16 кг. Проводилась стандартная подготовка животного к операции. Премедикация с внутримышечным введением коктейля следующего состава: анальгин 60 мг/кг (2 мл 50% раствора), димедрол 1,5 мг/кг (0,15 мл 1% раствора), дроперидол 0,5 мг/кг (0,2 мл 0,25% раствора) и 0,02 мг/кг сульфата атропина (1 мл 0,1% раствора). После трехкратной обработки операционного поля 3% настойкой йода произведена срединная лапаротомия. Операцию проводили под внутривенным наркозом с применением: рамитар 0,15 мл/кг, пропофол 13,5 мг/кг. После визуальной оценки состояния органов брюшной полости под рентгенконтролем выполнили селективную катетеризацию брыжеечной вены по Сельдингеру катетером Cobra 5F с эмболизацией ветвей портальной вены с применением нарезанных кусочков гемостатической губки. Одновременно проводили вмешательство, направленное на сужение полой вены проксимальнее впадения печеночных вен с обтурацией устьев печеночных вен в сочетании с подкожным введением 40% раствора четыреххлористого углерода в подсолнечном масле из расчета 2,0 мл/кг два раза в неделю.

После экспериментального моделирования цирроза печени в течение 1 месяца каждые 3-5 сутки производили трепанобиопсию печени экспериментального животного под контролем УЗИ при помощи трепана диаметром иглы G-18. Всего было проведено 4 биопсии, с каждого полученного биоптата готовились по 3 среза с разных участков. При этом в биоптате, выполненном на 17 сутки, верифицированы изменения, характерные для центролобулярного некроза печени с переходом в цирроз. Во время канюляции брыжеечной вены и после формирования цирроза печени с развитием портальной гипертензии измеряли давление в воротной вене, что составило от 96,8 до 277,9 мм вод.ст. соответственно.

В послеоперационном периоде также отмечено ухудшение показателей печеночного обмена в биохимических анализах крови.

Предлагаемый и апробированный в эксперименте способ является эффективной ускоренной методикой моделирования цирроза печени с синдромом портальной гипертензии. Предлагаемый способ легко воспроизводим в условиях эксперимента. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Способ моделирования цирроза печени с синдромом портальной гипертензии, включающий эмболизацию ветвей воротной вены экспериментальных животных, отличающийся тем, что эмболизацию ветвей воротной вены проводят путем катетеризации брыжеечной или селезеночной вены по Сельдингеру с селективной катетеризацией ветвей портальной вены печени с применением гемостатической губки, дополнительно проводят сужение полой вены проксимальнее впадения печеночных вен с обтурацией устьев печеночных вен, после чего подкожно вводят 40%-ный раствор четыреххлористого углерода в подсолнечном масле из расчета 2,0 мл/кг два раза в неделю.