Рекомбинантным продуцентом антигена гепатита в являются дрожжи
Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложен штамм дрожжей Hansenula polymorpha — продуцент рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа «ayw». Штамм был получен путем введения в геном клетки дрожжей нескольких копий последовательности ДНК, кодирующей HBsAg/ayw, под контролем промотора MAL1 H. polymorpha. Штамм обеспечивает высокий выход рекомбинантного белка HBsAg/ayw, обладающего антигенными и иммуногенными свойствами природного антигена, в улучшенных технологических условиях процесса культивирования на средах, не содержащих токсичных и огнеопасных компонентов, и обеспечивает соблюдение требований по защите окружающей среды. Изобретение может быть использовано для микробиологического получения рекомбинантного белка HBsAg. 3 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генной инженерии, и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа «ayw» (HBsAg/ayw).
Гепатит В — одна из самых распространенных вирусных инфекций, которая ведет к таким тяжелым последствиям как хронический гепатит, цирроз печени и гепатокарцинома. Успешное применение вакцин против гепатита В существенно улучшило эпидемиологическую ситуацию по гепатиту В, прежде всего в странах с широкой распространенностью данной инфекции, к которым относится и Россия. В настоящее время используемые для вакцинации препараты содержат поверхностный антиген вирусного гепатита В, полученный рекомбинантным путем. Такие вакцины эффективны и более безопасны, чем вакцины, приготовленные с использованием природного вируса.
Известны различные рекомбинантные штаммы, способные продуцировать поверхностный антиген вируса гепатита В.
Так, в патенте RU 2088664 описано получение HBsAg (ayw) с использованием штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203, содержащим рекомбинантную плазмидную ДНК pDES20. При всех известных преимуществах — эффективность, безопасность, система экспрессии HBsAg на основе S. cerevisiae имеет недостатки, связанные с проблемой достижения высокого выхода и низкой себестоимости целевого белка. Для увеличения уровня экспрессии, как правило, используют автономно реплицирующиеся мультикопийные векторы, требующие специальных селективных сред для предотвращения накопления бесплазмидных клеток в процессе культивирования штамма-продуцента. Это осложняет получение достаточного количества биомассы на единицу объема культуры. Другой проблемой использования автономно реплицирующегося экспрессионного вектора является существенная вариабельность его копийности в отдельных клетках культуры. В результате в клетках с низкой копийностью вектора уровень экпрессии гена оказывается недостаточно высоким, а слишком высокая копийность может приводить к неспособности белка принять правильную конформацию из-за его гиперпродукции, и только часть клеток культуры содержит оптимальное количество копий экспрессионного вектора, способное обеспечить максимальный выход целевого белка. В качестве индуцируемого промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка, как правило, применяют промотор гена GAL1, требующий для индукции использования больших количеств хорошо очищенной галактозы, являющейся достаточно дорогим веществом.
Известно использование рекомбинантных метилотрофных дрожжей для получения поверхностного антигена вируса гепатита В. Например, для получения HBsAg серотипа adw был создан штамм Pichia pastoris PS, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pHBS, обеспечивающую биосинтез HBsAg (RU 2201452). HBsAg в виде иммуногенных частиц размером 22 mn и молекулярной массой 24000 Da выделен при культивировании штамма дрожжей Pichia pastoris С226, трансформированных плазмидой ТАО 906 (ЕР 0864649).
В ближайшем аналоге (RU 2230782) описано создание трансформированного штамма дрожжей Pichia augusta — продуцента рекомбинантного HBsAg/ayw. Штамм был получен трансформацией штамма-реципиента DLT плазмидой, содержащей фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим HBsAg, под контролем промотора гена метанолоксидазы H. polymorpha (МОХ) и селективным маркером TRP3 H. polymorpha. Полученный штамм обладал высоким выходом HBsAg серотипа «ayw». Однако в процессе культивирования штамма в качестве индуктора добавляется метиловый спирт, относящийся к 3-му классу опасности, при работе с которым необходимо соблюдать соответствующие требования безопасности и охраны окружающей среды.
Задачей изобретения является создание эффективного микробиологического дрожжевого штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа ayw, антигенные свойства которого позволяли бы использовать его в качестве вакцины для защиты от вируса гепатита В. Под эффективностью понимается возможность получения целевого продукта, обладающего необходимыми биологическими свойствами (правильная конформация, иммуногенность, чистота) и низкой себестоимостью, при этом штамм должен обеспечивать улучшение технологических условий процесса культивирования.
Согласно изобретению, для получения рекомбинантного штамма Н. polymorpha — продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа «ayw», плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим HBsAg серотипа «ayw», под контролем промотора гена мальтазы К polymorpha (MALI) и селективным маркером (ген LEU2 S. cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма H.polymorpha DL1-L (Sohn J.H. et al., J Bacteriol. 1996, 178(15):4420-8). Для получения клонов, содержащих в геноме несколько копий плазмиды, применена процедура селекции множественной интеграции. По результатам проверки полученных в результате этой процедуры клонов на способность синтезировать белок поверхностного антигена вируса гепатита В был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. В процессе культивирования штамма в качестве индуктора добавляется сахароза. Полученный рекомбинантный штамм, содержащий несколько копий целевого гена под контролем промотора MALI, депонирован 24.03.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ-14/pAYmalt-l. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.
Штамм позволяет получать HBsAg, обладающий высокими антигенными и иммуногенными свойствами, обеспечивает улучшение технологических условий процесса культивирования, благодаря возможности избежать использование метилового спирта, имеющего 3-й класс опасности, обеспечивает соблюдение требований по защите окружающей среды.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.
В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний-производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Трансформацию клеток Escherichia coli и H. polymorpha осуществляли согласно ранее описанным методам (Inoue H. et. al., Gene, 1990, 96:23-28; Bogdanova A.I. et. al., Yeast, 1995, 11(4):343-53). Для полимеразной цепной реакции (ПНР) использовали полимеразу Pwo (Roche). Синтез олигонуклеотидов, а также определение последовательности нуклеотидов производились ЗАО «Евроген» г. Москва.
Пример 1. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего несколько копий рекомбинантного гена, кодирующего полипептид HBsAg/ayw, под контролем промотора MALI.
Получали плазмиду pMAL-AYW1 (Фиг. 1; SEQ ID ΝΟ:1), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид HBsAg/ayw, под контролем промотора MALI (SEQ ID NO: 1, нуклеотидные позиции 1-2024). Помимо этого гена плазмида pMAL-AYWl состояла из: (а) фрагмента плазмиды рАМ619 (Agaphonov M., Alexandrov Α., FEMS Yeast Res., 2014, 14(7): 1048-54), включающего бактериальный селективный маркер устойчивости к ампициллину и дрожжевой селективный маркер — модифицированный ген LEU2 S. cerevisiae (SEQ ID NO: 1, нуклеотидные позиции 2913-6326), (б) фрагмента плазмиды AMIpSLl (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15(7):541-51), несущего терминатор транскрипции и автономно-реплицирующуюся последовательность Н. polymorpha, (SEQ ID NO: 1, нуклеотидные позиции 2025-2912) и (в) линкерной последовательности (SEQ ID NO: 1, нуклеотидные позиции 6327-6403).
Штамм DL1-L трансформировали плазмидой pMAL-AYW1. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. Несколько выросших трансформантов посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших колоний отобрали самые крупные и снова посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока вырастающие при рассеве колонии не стали одинаковыми по скорости роста. По одному такому субклону нескольких независимых трансформантов отобрали для анализа продукции белка HBsAg/ayw. Трансформант с лучшей продуктивностью был обозначен КБТ-14/pAYmalt-1.
Пример 2. Культивирование штамма Н. polymorpha КБТ-14/pAYmalt-1.
Ферментацию штамма-продуцента Н. polymorpha осуществляли в два этапа. На первом этапе культивирования в режиме фед-бэтч при температуре 30°С наращивали биомассу в культуральной среде, содержащей 4% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона и 4% глицерина. Процесс вели до истощения источника углерода в питательной среде и прекращения роста биомассы. На втором этапе культивирование проводили с подпиткой культуры путем непрерывной подачи 30%-ного раствора дрожжевого экстракта. Одновременно с подпиткой добавляли индуктор (раствор сахарозы, 40% вес/объем), который добавляли порциями по 0.5% (вес сахарозы / объем культуральной жидкости) через каждые два часа в течение 48-72 часов. Продолжительность всего процесса составляла около 96 часов.
Пример 3. Выделение и очистка рекомбинантного белка HBsAg/ayw из клеток Н. polymorpha.
После ферментации белок HBsAg/ayw (SEQ ID NO: 2) выделяли согласно опубликованной методике (Lunsdorf H. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10:48) с небольшими изменениями. Клетки из культуральной жидкости осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 минут при 4°С. Осажденную биомассу ресуспендировали до исходного объема в карбонатно-солевом буферном растворе для экстракции (50 mM NaHCO3, 150 mM NaCl, рН 8.0) и снова осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 минут при 4°С. Полученную таким образом отмытую биомассу ресуспендировали в буферном растворе для экстракции с добавлением 1.7mM EDTA и 2 mM PMSF до концентрации 400 г влажных клеток на литр суспензии. Далее клетки разрушали в проточном дезинтеграторе Dyno-Mill типа KDL при температуре 5-10°С, используя стеклянные шары диаметром 0.5-0.7 мм. Для удаления клеточного дебриса полученный гомогенизат центрифугировали при 4000g в течение 60 минут при 4°С.
Полученный осветленный гомогенизат подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на системе Sartocon через мембрану с порогом отсечения 300 kDa (Sartorius, Германия), одновременно концентрировали и переводили в фосфатно-солевой буферный раствор (10mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 6.8). При этом отделяется большая часть примесных низкомолекулярных белков.
Дальнейшую очистку проводили методом адсорбционной хроматографии на колонке с макропористым стеклом (МПС) с использованием технологии Streamline (хроматография в восходящем потоке). Концентрированный раствор HBsAg/ayw, полученный после ультрафильтрации, наносили на колонку при скорости 1 мл/мин, промывали 3-4 объемами фосфатно-солевого буферного раствора (рН 6.8) и элюировали карбонатным буфером (50mM NaHCO3, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 9.5).
Объединенные фракции, содержащие HBs антиген (определяли по иммуноблоту и SDS-PAGE), концентрировали ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембране 300 KDa и разделяли при помощи зонального ультрацентрифугирования (Beckman Coulter, USA) в градиенте плотности сахарозы (20-50% вес./вес.). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, а затем очищали гель-фильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (Tosoh Bioscience, Japan) в фосфатном буферном растворе (10mM NaH2PO4, 0.03% Tween-20, рН 7.2).
Если чистота белка на данной стадии была недостаточна (менее 95%), производили дополнительную очистку при помощи анионообменной хроматографии на сорбенте Toyopearl DEAE-650M (Tosoh Bioscience, Japan).
В результате этих операций удается выделить около 30% антигена, присутствующего в осветленном клеточном лизате. Выход очищенного HBsAg/ayw составлял не менее 50 мг/л культуральной жидкости.
Пример 4. Анализ рекомбинантного HBsAg/ayw.
1) Чистота рекомбинантного HBsAg/ayw определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) путем окрашивания с Coomassie Brilliant Blue R-250 и/или серебром (Фиг. 2A). Анализ интенсивности полос отсканированных гелей проводится посредством компьютерной программы NIH Image.
2) Иммуноспецифичность рекомбинантного HBs антигена определяют методом иммуноблотинга. Первичные антитела для этой цели получали иммунизацией кроликов рекомбинантным HBsAg (ЗАО НПК «Комбиотех»), восстановленным в присутствии 2% SDS и 5% β-меркаптоэтанола. Из полученных высокоиммуных сывороток специфические поликлональные антитела выделяли на афинном сорбенте с конъюгированным рекомбинантным HBsAg (Крымский М.А. et. al., Биофармацевтический Журнал, 2010, 2(5):8-15). Этими антителами окрашивали иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам кроликов, конъюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген HBsAg/ayw представлен в виде полосы мономера белка размером 22-25 кДа и полос димера и тримера (Фиг. 2Б).
3) Образование вирусоподобных частиц (ВПЧ) рекомбинантного белка HBsAg/ayw подтверждали методом гель-фильтрационной хроматографии на полимерной колонке TSK G5000PW диаметром 7.5 мм и длиной 60 см, соединенной с предколонкой PrePW диаметром 7.5 мм и длиной 7.5 см (Tosoh Bioscience, Japan). Разделение проводили в фосфатном буферном растворе (10mM КН2РО4, (рН 7.2), 0.03% Tween-20) при скорости потока 0.6 мл/мин. Мониторинг процесса осуществляли по поглощению на 280 нм. Размер пор сорбента 1000 Å позволяет отделить правильно собранные ВПЧ от мономеров и агрегатов HBs-антигена. Время элюции очищенного препарата HBsAg/ayw соответствует времени элюции вирусоподобных частиц 23-26 мин (Фиг. 3).
4) Иммуногенность рекомбинантного антигена HBsAg/ayw, определенная в тесте «in vivo» на мышах линии Balb/c с массой 12-14 г в расчете на ED50 (доза антигена, вызывающая сероконверсию у 50% мышей), составляет 0.05-0.1 мкг.
Культурально-морфологические особенности штамма: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой. Хранение штамма — при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина.
Генетические особенности: штамм не является зоопатогенными или фитопатогенными.
Способ, условия и состав сред для размножения штамма: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.
Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 30°С и рН 5.5-6.0 в питательной среде, содержащей до 4% глицерина.
Выделенный белок HBsAg/ayw может быть использован в тест-системах, а также для создания на его основе вакцин для профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом гепатита В.
Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha КБТ-14/pAYmalt-1, содержащий интегрированные в геном несколько копий фрагмента ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим полипептид HBsAg/ayw, под контролем промотора гена MALI H. polymorpha (SEQ ID NO:1, нуклеотидные позиции 1-2024) — продуцент рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа «ayw».
Источник
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента, обеспечивающего высокий выход рекомбинантного антигена вируса гепатита В серотипа adw. Путем проведения генно-инженерных операций с использованием определенных олигонуклеотидов получают штамм дрожжей Hansenula polymorpha VKPM Y-2412, трансформированный последовательностью ДНК, кодирующей HBsAg/adw, слитой с промотором гена МОХ и геном TRP3, являющийся продуцентом рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В. Изобретение позволяет достичь более высоких уровней синтеза антигена при упрощении способов получения культур высокой плотности.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генной инженерии, и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В.
Известны различные штаммы, являющиеся продуцентами поверхностного антигена вируса гепатита В.
Известен штамм Е.coli ВКПМ В-6955, являющийся продуцентом корового антигена вируса гепатита В. Для получения штамма — продуцента кор антигена с экспонированным на его поверхности главным нейтрализующим эпитопом HBsAg, компетентные клетки бактерий Е.coli JM 103 трансформируют сконструированной плазмидой рКНВс33 (RU, патент 2112039, 1995, С 12 N 15/51).
Известен также штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae KCTC 0098BP, являющийся продуцентом поверхностного антигена вируса гепатита В, содержащего пре S2 пептид (RU, патент №2122430, 1995, C 12 N 15/51).
Аналогом изобретения является патент, в котором описан штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203 — продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В (Патент РФ №2088664, 1996, А 61 К 39/29).
При осуществлении изобретений в соответствии с указанными патентами невозможно добиться высоких уровней синтеза антигена.
Задачей изобретения является создание эффективного микробиологического дрожжевого продуцента, обеспечивающего высокий выход рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа adw.
Задача решена тем, что согласно изобретению одна копия синтетической последовательности ДНК, кодирующей HBsAg/adw, интегрирована в геном штамма Hansenula polymorpha. Для увеличения уровня синтеза антигена используется штамм с нарушенным геном МОХ, кодирующем алкогольоксидазу. Отсутствие мутаций, которые могли образоваться в гене, кодирующем HBsAg/adw, в процессе его введения в геном дрожжей или при культивировании штамма-продуцента, может быть выявлено определением нуклеотидной последовательности продукта полимеразной цепной реакции с праймерами к этому гену.
Дрожжи Н. polymorpha являются предпочтительными по сравнению с S. cerevisiae, поскольку позволяют добиваться более высоких уровней синтеза антигена при более простых способах получения культур высокой плотности.
Высокий уровень синтеза полипептида в клетках дрожжей достигается при помощи введения в клетки одной копии клетки гена, его кодирующего.
Заявленный штамм дрожжей Н. polymorpha, являющийся продуцентом поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа ad, является новым и в патентной литературе не описан.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами. При этом все рутинные генно-инженерные операции осуществляют согласно стандартным методикам и инструкциям компаний — производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Для ПЦР во всех случаях использовали полимеразу Vent (NEB). Синтез олигонуклеотидов производился ЗАО “Синтол” г. Москва. В работе для получения антигена серотипа adw использовали следующие олигонуклеотиды:
Пример 1. Получение фрагмента ДНК, кодирующего HBsAg/adw (фрагмент А)
Реакционную смесь, содержащую олигонуклеотиды 1u и 8L по 1 мкМ, олигонуклеотиды со 2u по 8u; с 1L по 7L по 10 пМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 тМ tris-HCl pH 8.8, 10 тМ (NH4)2SO4, 2 mМ MgSO4, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 90 сек. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле, и изолируют фрагмент размером 730 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.
Пример 2. Получение фрагмента геномной ДНК Н. polymorpha, содержащего промотор гена МОХ (фрагмент Б)
Суспендируют 2-3 мкг клеток штамма Hansenula polymorpha BKM 4-2559 (получен из почвы СС4 38-22-2 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН) в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин. 1 мкл полученного супернатанта добавляют к 25 мкл смеси, содержащей олигонуклеотиды moxU5 и moxL3 по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mМ tris-HCl pH 8.8, 10 mМ (NH4)2SO4, 2 mМ MgSO4, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 90 сек. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 850 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.
Пример 3. Получение фрагмента геномной ДНК Н. polymorpha, содержащего часть гена TRP 3 (фрагмент В)
Суспендируют 2-3 мкг клеток штамма Н. polymorpha BKM 4-2559 в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин. 1 мкл полученного супернатанта добавляют к смеси, содержащей олигонуклеотиды trpU5 и trpL3 по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl pH 8.8, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton Х-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 120 сек, при 50С 30 сек, при 72С 120 сек. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 1360 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.
Пример 4. Получение фрагмента ДНК Н. polymorpha, содержащего последовательность, кодирующую HBsAg/adw, слитую с промотором МОХ и геном TRP 3 (фрагмент Г)
Реакционную смесь (0,05 мл), содержащую олигонуклеотиды moxU5 и trpL3 по 1 мкМ, фрагменты А, Б и В по 1 пг, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl рН 8.8, 10 mM (NH4)SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 3 мин. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 2,9 тысяч пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.
Пример 5. Интеграция последовательности, кодирующей HBsAg/adw, в геном Н. polymorpha
Штамм Н. polymorpha DLT (Agaphonov et al., 2002; коллекция штаммов лаборатории молекулярной генетики РКНПК МЗ РФ) выращивают в течение 15-20 часов в среде YNB-D, содержащей триптофан 20 мг/л, при 37С в условиях интенсивной аэрации. 0,5 мл культуры добавляют к 30 мл такой же среды и инкубируют в тех же условиях в течение 4 часов. Клетки собирают центрифугированием при 3000g 5 мин и суспендируют в 15 мл буфера Т (10 mМ tris-HCl pH 7,4; 100 mМ СН3СООLi; 0,5 mМ EDTA). После инкубации в течение 30 мин при 30С клетки вновь осаждают и суспендируют в 200 мкл буфера Т. К 0,05 мл суспензии добавляют 1 мкг фрагмента Г, перемешивают, добавляют 120 мкл 70% раствора ПЭГ 4000, вновь перемешивают и инкубируют 1 час при 30С.
Трансформационную смесь инкубируют при 45С 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и высевают на чашки Петри со средой, содержащей 50 мг/мл лейцина. Выросшие колонии трансформантов проверяют на способность расти на среде, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода. Отбирают клоны, неспособные расти на такой среде, и проверяют их на способность синтезировать HBsAg/adw. Полученный штамм дрожжей Н. polymorpha является продуцентом поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg/adw). Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов в ГНИИ генетики под номером VKPM Y -2412. Справка о депонировании штамма прилагается.
Пример 6. Анализ способности штамма синтезировать HBsAg/adw
Тестируемый штамм засевают в среду YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% глюкозы) и инкубируют при 37С в течение 15-20 часов в условиях высокой аэрации. Полученную культуру разводят в пять раз средой YPM (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% метанола) и инкубируют в тех же условиях в течение 30-50 часов. Клетки из 0,5 мл культуры собирают центрифугированием, суспендируют в 0,2 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл 0,2 М NaOH и инкубируют на кипящей водяной бане 8 мин. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10000 g, после чего супернатант анализируют методом электрофореза и иммуноблоттинга с использованием антител к HBsAg/adw. В качестве стандарта используют очищенный белок HBsAg/adw. В дорожках, соответствующих штаммам, которые синтезируют HBsAg/adw, выявляется полоса на уровне 24-27 кДа такая же, как и в случае очищенного белка.
Пример 7. Определение последовательности гена HBsAg/adw в геноме дрожжей.
Суспендируют 2-3 мкг клеток анализируемого штамма в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин. 1 мкл полученного супернатанта добавляют к смеси, содержащей олигонуклеотиды МОХ и TRP по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl pH 8.8, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton Х-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95С в течение 30 сек, при 50С 30 сек, при 72С 2 мин. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 800 пар оснований. Фрагмент секвенируют с использованием праймеров МОХ и TRP. Совпадение результатов секвенирования с исходной последовательностью показывает отсутствие мутаций в интегрированном в геном дрожжей гене HBsAg/adw.
Пример 8. Выделение HBsAg(adw) из клеток Н. polymorpha
После ферментации исходного штамма дрожжей Н. polymorpha антиген HBsAg выделяют согласно общепринятой методике по следующей схеме. Клетки из культуральной жидкости осаждают центрифугированием при 4000 g на центрифуге Beckman. Осажденную биомассу ресуспендируют до концентрации 250 г влажных клеток на 1 литр в буфере экстракции PBS pH 6,8 с добавлением EDTA, PMSF и Tween-20. Далее клетки разрушают в мельнице Dyno-Mill типа KDL, используя стеклянные шары диаметра 0,5-0,7 мм. Основную массу нецелевых белков из полученного гомогенизата осаждают добавлением полиэтиленгликоля (PEG) до концентрации 4,5%. Осажденные белки отделяют центрифугированием. Полученный супернатант фильтруют на ультрафильтрах (500кДа) Pellicon. При этом отделяются белки с мол. массой меньше 500 кДа, а также удаляется PEG и раствор HBs антигена переводится в буфер PBS рН 6,7. Одновременно происходит концентрирование раствора, что существенно для следующей стадии абсорбции на стекло. Посадку HBsAg на макропористое стекло (МПС) осуществляют в колонках системы StreamLine, разработанной фирмой Pharmacia (Sweden). Для удаления неспецифически связанных белков колонку промывают тем же буфером PBS. Антиген элюируют карбонатным буфером (КБ) рН 9,5. Элюат концентрируют ультрафильтрацией и разделяют при помощи ультрацентрифугирования на зональном роторе (Beckman) в градиенте глицерин/сахароза. Полученные фракции анализируют на содержание HBsAg, используя РОПГА набор и фракции, содержащие антиген, объединяют и очищают гельфильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (ToyoSoda Corp., Japan). Чистоту полученного таким образом HBs антигена определяют методом SDS-PAGE. Если чистота продукта недостаточна (<95%), производят дополнительную очистку при помощи ионообменной хроматографии на сорбенте TSK-DEAE (ToyoSoda Corp., Japan). Выход антигена 25-30 мг с 1 л культуральной жидкости.
Полученный раствор HBsAg анализируют рядом методов:
1. Антигенную активность измеряют наборами РОПГА (реакция обратной пассивной гемагглютинации эритроцитов) по методике производителя (НПО “Диагностические Системы”, Нижний Новгород) с использованием в качестве стандарта отраслевой стандартный образец активности HBsAg (ОСО 42-28-153-88), выпускаемый ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
2. Чистота рекомбинантного HBsAg определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) с окрашиванием серебром и Coomassie Brilliant Blue R-250. Чистота выделенного антигена не <95%.
Видовое название культуры Hansenula Polymorpha.
Культурально-морфологические особенности штамма: клетки округлой формы, небольшие по размеру; на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой.
Активность штамма — не менее 30 мг/л культуральной жидкости.
Хранение при -70С в виде суспензии клеток в стерильном (30-50)%-ном растворе глицерина.
Генетические особенности: ауксотроф по лейцину, фаги у дрожжей не обнаружены.
Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным.
Способ определения активности: в осветленном гомогенизате клеток методом иммуноферментного анализа.
Способ, условия и состав сред для размножения штамма: инкубирование прокачиванием при 30С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.
Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 29±1С и рН 5,0-5,5 в среде, содержащей до 10-15% глицерина и соли.
Выделенный антиген вируса гепатита В серотипа adw может быть использован для создания на его основе вакцин против гепатита В.
Формула изобретения
Штамм дрожжей Hansenula polymorpha VKPM Y-2412, трансформированный последовательностью ДНК, кодирующей HBsAg/adw, слитой с промотором гена МОХ и геном TRP3, — продуцент рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В.
Источник
