Рекомбинантным продуцентом антигена гепатита в являются один верный ответ

Антитела к HBs-антигену (HBsAg) вирусного гепатита В (ВГВ) обладают протективными (защитными) свойствами. Этот факт лежит в основе вакцинопрофилактики. В настоящее время в качестве вакцины против гепатита В, в основном, применяют препараты рекомбинантного HBsAg. Эффективность иммунизации оценивают по концентрации антител к HBsAg (антиHBs) у вакцинированным лиц. Согласно данным ВОЗ, общепринятым критерием успешной вакцинации считается концентрация антител, превышающая 10 — мМЕ/мл.

Вакцинирование лиц, перенесших ВГВ – инфекцию, не только экономически не целесообразно, но и означает неоправданную антигенную нагрузку на иммунную систему человека. Поэтому, перед началом вакцинации необходимо провести скрининг лиц, подлежащих иммунизации, на наличие в крови HBsAg, антиHBs, HBсore–антител. Присутствие хотя бы одного из перечисленных маркеров является отводом от вакцинации против гепатита В.

Несмотря на то, что современные вакцины характеризуются высокой иммуногенностью, проведение вакцинации не всегда обеспечивает защиту организма человека от возможного инфицирования ВГВ. По литературным данным, протективный уровень антител после окончания курса вакцинации не достигается в 2-30% случаев. Помимо качества вакцины, на эффективность иммунного ответа влияют многие факторы, определяющим из них является возраст привитых. Максимальный иммунный ответ у человека наблюдается в возрасте от 2 до 19 лет. Наиболее слабый иммунный ответ на вакцинацию характерен для людей в возрасте 50 лет и старше. Об этом также свидетельствуют данные проведенных исследований среди медицинских работников медицинских организаций г. Липецка и области клинико-иммунологической лабораторией ГУЗ «ЛОЦПБС и ИЗ» в 2016 году.

Возраст медработников	Всего обследовано проб	из них:
Возраст медработников	Всего обследовано проб	титры анти- HBsAg ниже защитного уровня	защитный титр антител
До 30 лет	441	125 (28,3%)	316 (71,7%)
30-50 лет	1890	603 (31,9%)	1287 (68,1%)
Более 50 лет	1141	483 (42,3%)	658 (57,7%)

Возрастное снижение иммунного ответа более выражено у мужчин, чем у женщин. Резистентность к прививке может наблюдаться среди иммунокомпетентных лиц: ВИЧ-инфицированных, больных с хроническими заболеваниями и др. Кроме того, имеются данные о влиянии веса вакцинируемого на величину иммунного ответа.

По окончании курса вакцинации (через 1-2 месяца) необходимо контролировать концентрацию антиHBs в крови привитых. Ряд исследователей считает, что после полного цикла вакцинации концентрация антиHBs должна составлять 100 мМЕ/мл и более, поскольку при ее более низких значениях у вакцинированных происходит быстрое снижение протективных антител до < 10 мМЕ/мл. Разделяя эту точку зрения, Sherlock и Dooley (1997) выделяют три варианта ответа на вакцинацию против ВГВ:

отрицательный результат, или неэффективна вакцинация, < 10 мМЕ/мл,
слабый ответ – от10 до 99 мМЕ/мл,
достаточный ответ – 100 мМЕ/мл и более.

В ряде исследований показано, что, если по окончании курса вакцинации не достигнут протективный уровень антиHBs, к положительному результату может привести однократное введение бустер-дозы вакцины через год после проведения первичного курса вакцинации.

С течением времени концентрация анти – HBs в крови многих вакцинированных опускается ниже протективного уровня, и актуальным становится вопрос о необходимости проведения ревакцинации. Согласно современным представлениям, большинство вакцинированных не нуждается в бустерной дозе вакцины. Благодаря иммунологической памяти, длительный поствакцинальный иммунитет сохраняется даже в тех случаях, когда концентрация анти- HBs снижается до непротективных значений. Введение бустер-дозы рекомендовано лишь иммунокомпрометированным лицам (гемодиализ, хроническая почечная недостаточность, заболевания печени, ВИЧ-инфицированных и т.д.)

В лаборатории ГУЗ «ЛОЦПБС и ИЗ» проводятся серологические исследования крови на наличие HBsAg, антиHBs, HBсore–антител.

врач клинической лабораторной диагностики

Ефимова О.Ю.

Источник: www.aids48.ru

Читайте также

Вид:

grid

list

Источник

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, в частности к получению рекомбинантной плазмидной ДНКpКНВc-33, содержащей ген корового антигена вируса гепатита B (НВcAg) с экспонированным на его поверхности главным нейтрализующим эпитопом поверхностного антигена вируса гепатита B (137-147) (HBsAg) и соответствующего штамма-продуцента. Плазмида содержит также конструктивные элементы, необходимые для обеспечения экспрессии гибридного белка в клетках штамма-продуцента. Для получения штамма-продуцента компетентные клетки бактерии Escherichia coli IM103 трансформируют плазмидой рКНВс-33. Полученный штамм E. coli IM103/рКНВс-33 обеспечивает индуцируемый синтез НВсАg-HBsAg (137-147) с уровнем экспрессии около 5% от суммарного клеточного белка. 2 с.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, биотехнологии. Конкретно — к получению корового антигена вируса гепатита B (HBcAg), с экспонированным на его поверхности эпитопом HBsAg.

Вирусные капсиды являются благодарным объектом для конструирования антигенов с заданными свойствами, поскольку жесткая фиксация и многократное повторение антигенных детерминант на поверхности вирусных капсидов обеспечивают их высокую антигенность и иммуногенность. Конструирование вирусных капсидов, экспонирующих чужеродные эпитопы, обещают стать перспективным направлением в создании эффективных вакцин [1]. Одним из наиболее многообещающих векторов экспонирования чужеродных детерминант является нуклеокапсидный белок вируса гепатита B человека (HBcAg) [2]. Он представляет собой капсид, состоящий из 180 одинаковых белковых субъединиц, способных к самоорганизации. Способность субъединиц к самосборке сохраняется как в эукариотических, так и в прокариотических системах экспрессии [3]. Химерные капсиды на основе HBcAg могут быть использованы в первую очередь как компоненты диагностикумов и вакцин. Последнее тем более перспективно, что HBcAg при иммунизации не только обеспечивает высокий уровень образования опосредованных B-клеточных иммунитетов антител, но и обладает ярко выраженным свойством стимулировать T-клеточный иммунный ответ как на собственные последовательности [4], так и на сопутствующие эпитопы [2]. В настоящее время в литературе описаны способы получения химерных частиц HBcAg, несущих эпитопы различных вирусов: вируса ящура (FMDV), риновируса человека (HRV2) [2] , вируса гепатита B [5, 7], вируса гепатита C [6]. Химерные частицы были способны индуцировать иммунный ответ на встроенный пептид при иммунизации лабораторных животных. Известны конструкции HBcAg, несущие детерминанты HBsAg [5, 8], в которых preS1 и preS2 эпитопы встраивались в C-конец укороченного по 144 аминокислотный остаток кор-антигена вируса гепатита B. Такие химерные белки хорошо самоорганизовывались в частицы, подобные нативному кору, однако иммунный ответ на встроенную детерминанту был невысок (на три порядка ниже, чем на HBcAg). Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа, является рекомбинантная плазмида pFS14 [7, прототип], несущая полноразмерный ген HBcAg, содержащий последовательность эпитопа preS2 (133-140) в области, соответствующей 83 аминокислотному остатку корового белка. К существенным недостаткам описанного аналога следует отнести низкий уровень экспрессии (1% суммарного клеточного белка). Встроенный эпитоп из области preS2 (133-140) представляет собой минорную антигенную детерминанту HBsAg, а основным протективным эпитопом, вызывающим появление противовирусных антител, является детерминанты «а» — главный нейтрализующий эпитоп HBsAg [9]. Поэтому, если предлагать использование гибридного HBcAg в качестве компонента диагностикумов или вакцин, то более подходящим является главный нейтрализующий эпитоп HBsAg (137-147). Технической задачей изобретения является создание химерных частиц HBcAg, содержащих последовательность главного нейтрализующего эпитопа HBsAg (137-147) и бактериального штамма Escherichia coli — продуцента белка HBcAg с экспонированным на его поверхности эпитопом HBsAg (137-147). Поставленная цель достигается конструированием плазмиды pKHBc-33 путем клонирования гена HBcAg, содержащего последовательность эпитопа HBsAg (137-147), в экспрессионный вектор pKK223-3. Полученная в результате плазмида pKHBc-33 состоит из: фрагмента генома вируса гепатита B размеров 890 п.о., кодирующего HBcAg и содержащего уникальный рестрикционный сайт Xho I и эпитоп HBsAg (137-147); плазмидного вектора, обеспечивающего экспрессию гена HBcAg-HBsAg (137-147), с молекулярной массой 3,03 Md (4585 п.о.). В качестве фрагмента генома вируса гепатита B (ayw серотипа) используют BamHI фрагмент плазмиды p7,5C [10] длиной 890 п.о., содержащий С-ген вируса гепатита B, в котором делетированы первые 3 аминокислотных остатка. В качестве олигонулеотида-мутагена, для введения мутации по методу [11], обеспечивающей появление уникального Xho I сайта, используют синтетический фрагмент ДНК: 5′-ctaggtccctcgagattggatc-3′. В качестве фагового вектора, обеспечивающего встройку C-гена и необходимого для введения мутации, используют бактериофаг M13mp10 [12]. В качестве плазмидного вектора, обеспечивающего встройку C-гена и его экспрессию под контролем tac промотора, используют плазмиду pKK223-3 [13], а в качестве адаптора для соединения плазмиды с геном используют олигонуклеотид, который восстанавливает начало гена HBcAg: 5′-aattcatggacatt gtacctgtaactag-5′ Для введения эпитопа HBsAg(137-147) в HBcAg, проводят клонирование соответствующего олигонуклеотида по введенному Xho I сайту. Олигонуклеотид, кодирующий пептид, имеет следующую последовательность; 5′-tcgatctgcaccaaaccgaccgatggcaactgc agacgtggtttggctggctaccgttgacgagct-5′ Для получения штамма-продуцента кор антигена с экспонированным на его поверхности главным нейтрализующим эпитопом HBsAg, компетентные клетки бактерий Escherichia coli JM103 трансформируют сконструированной плазмидой pKHBc33. Полученный таким образом штамм E.coli JM103/pKHBc33 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Культурные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре «Дифко» — колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB бульоне) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при 37oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,0. Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды. Штамм E. coli JM103/pKHBc33 обеспечивает индуцируемый ИПТГ синтез HBcAg-HBsAg (137-147) с уровнем экспрессии около 5% суммарного клеточного белка. Полученный штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов во ВНИИ генетики под номером ВКПМ В-6955. Сущность изобретения заключается в том, что для экспрессии C-гена вируса гепатита B фрагмент BamHI клонируют по EcoRI сайту плазмиды pKK223-3 [13] с использованием синтетического линкера EcoRIBam HI. Затем проводят клонирование синтетического фрагмента ДНК, кодирующего последовательность эпитопа HBsAg, по Xho I сайту (Xho I сайт вводят предварительно с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза, в область, соответствующую 81-82 аминокислотным остаткам HBcAg). В результате получают целую плазмиду pKHBc-33, кодирующую полноразмерный ген HBcAg, содержащий главный нейтрализующий эпитоп HBsAg (137-147). Экспрессию гибридного HBcAg осуществляют в клетках E.coli JV103 с использованием индуктора ИПТГ. Индикацию экспрессии осуществляют с помощью белкового электрофореза и иммуноблоттинга. Рекомбинантный белок узнается антисывороткой, используемой в качестве положительного контроля в тест-системе «Векто-HBcAg антитела» (АО «Вектор Бест»; Россия) и моноклональными антителами к HBsAg. Уровень экспрессии определяют с помощью денситометрии полиакриламидного геля, окрашенного Кумасси. Уровень экспрессии составляет около 5% суммарного клеточного белка. С помощью электронной микрофотографии показано, что продуцируемый белок собирается в частицы, по форме и морфологии подобные природному кору. Таким образом, впервые получены плазмидная ДНК и штамм-продуцент, обеспечивающие экспрессию HBcAg с экспонированным на его поверхности главным нейтрализующим эпитопом HBsAg (137-147). На фиг. 1 представлена схема плазмидной ДНК pKHBc-33 способа ее конструирования. BamHI, Xho I, EcoRI — сайты рестрикции; Klenov — фрагмент Кленова ДНК полимеразы I E.coli; ligase — ДНК-лигаза фага Т4; adapter — адаптор EcoRI-BamHI; —^^— -олигонуклеотид-мутаген; Ptac — tac промотор; Amp — ген устойчивости к ампициллину; oligonuc-leotide — олигонуклеотид, кодирующий последовательность эпитопа HBsAg (137-147). На фиг. 2 — анализ клеточного лизата штамма E.coli JM103, несущего плазмиду pKHBc-33 в 12%-ном полиакриламидном геле и денситометрия геля. 1 — лизат клеток E.coli, трансформированных плазмидой pKHBc-33; 2 — денситограмма геля (стрелкой указан пик, соответствующий белку HBcAg-HBsAg (137-147). На фиг. 3 — электронная фотография рекомбинантного HBcAg и гибридного белка HBcAg-HBsAg (137-147), меченного иммунным золотом. Частицы предварительно инкубируются с моноклональными антителами к HBsAg, а затем конъюгатом анти-IgG с золотом. Далее препараты готовят методом негативного контрастирования 2%-ным раствором фосфорновольфрамовой кислоты и исследуют в электронном микроскопе. 1 — рекомбинантный HBcAg; 2 — гибридный белок HBcAg-HBsAg (137-147). Пример 1. Способ конструирования плазмиды pKHBc-33. 1.1. Способ введения уникального Xho I сайта в область 81 аминокислотного остатка HBcAg. В качестве источника C-гена используют плазмиду p7,5C [9], содержащую BamHI фрагмент ДНК (890 п.о.) вируса гепатита B, субтипа ayw. 50 мкг плазмиды p7,5C расщепляют BamHI эндонуклеазой в реакционной смеси, содержащей 100 ед. BamHI, 50 mM трис-HCl pH 7,6; 10 mM MgC12, 100 mM NaCl; 1 mM DTT. Реакцию ведут 1 ч при 37oC. После этого фрагмента ДНК длиной 890 п.о., содержащий C-ген с делетированными нуклеотидами, соответствующими первым трем аминокислотным остаткам HBcAg, выделяют методом электрофореза в агарозном геле с последующей электроэлюцией. Отдельно расщепляют репликативную форму ДНК фага M13mp10 BamHI эндонуклеазой, инактивируют фермент прогреванием при 68oC 30 мин и лигируют с 1 мкг BamHI фрагмента плазмиды p7,5C в стандартных условиях. Полученной лигазной смесью транс-формируют компетентные клетки E.coli JM109(RecA-). С помощью рестрикционного анализа отбирают клоны, содержащие вставку и обозначаемые далее M13HBc. Отобранные клоны используют для наработки одноцепочечной ДНК и проведения мутагенеза по методу Золлера-Смита [11]. 1 пмоль одноцепочечной ДНК M13HBc смешивают с 20-кратным избытком олигонуклеотида, несущего запланированную мутацию в 10 мкл раствора, содержащего 20 мМ DTT. Пробирку с реакционной смесью нагревают до 75oC и постепенно охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют 10 мкл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 10 mM MgC12, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 4 ед.акт. ДНК-лигазы, 2 ед.акт. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и инкубируют смесь в течение ночи при 10oC. Смесью трансформируют клетки E. coli JM103. Клоны, содержащие мутантный фаг, отбирают гибридизацией, с использованием в качестве зонда олигонуклеотида-мутагена. Отобранные фаговые ДНК, обозначенные M13HBcX, анализируют с помощью рестрикционного анализа и секвенирования по методу Сэнгера [14]. 1.2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pKHBc-33. Репликативную форму ДНК M13HBcX разрезают эндонуклеазой BamHI. Фрагмент ДНК, содержащий мутантный C-ген, несущий уникальный Xho I сайт, выделяют из агарозного геля с помощью электроэлюции. Плазмиду pKK223-3 расщепляют EcoRI нуклеазой, инактивируют фермент прогреванием при 68oC 30 мин, добавляют синтетический линкер EcoRI-BamHI (восстанавливающий начало гена HBcAg) и лигируют с 1 мкг BamHI фрагмента фага M13HBcX. Полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli JM103. С помощью рестрикционного анализа отбирают клоны, содержащие вставку. Полученную плазмиду обозначают pKHBc. Затем плазмиду pKHBc разрезают эндонуклеазой Xho I и лигируют с синтетическим фрагментом, кодирующим последовательность эпитопа HBsAg (137-147). Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают pКHBc-33. Схема плазмидной ДНК pKHBc-33 и способ ее конструирования представлены на фиг. 1. Пример 2. Характеризация рекомбинантного белка HBcAg-HBsAg (137-147) — продукта плазмиды pKHBc-33. Клетки E.coli JM103, содержащие плазмиду pKHBc-33, растят на среде LB до плотности 0,2 при D550, затем добавляют 0,1 mM ИПТГ (изопропил—D-галактопиранозид) и растят в течение ночи. Биомассу собирают центрифугированием и анализируют с помощью электрофореза по Лэммли и иммуноблоттинга с антисывороткой к HBcAg и моноклональными антителами к HBsAg. При сканировании полосы в полиакриламидном геле, соответствующей HBcAg, показан уровень продукции, составляющий 5% суммарного клеточного белка (фиг. 2). Выделенные с помощью ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы частицы гибридного HBcAg-HBsAg исследуют с помощью электронной микроскопии. В полученных препаратах обнаружены частицы по форме и морфологии аналогичные природному кору. Гибридные частицы инкубируют с моноклональными антителами к HBsAg, а затем конъюгатом анти-IgG с золотом. Электронная фотография белка HBcAg-HBsAg (137-147), меченного иммунным золотом (фиг. 3), показывает, что встроенный эпитоп HBsAg экспонирован на поверхности частицы. Таким образом, впервые получены плазмидная ДНК и бактериальный штамм-продуцент, обеспечивающие экспрессию корантигена вируса гепатита B с экспонированным на его поверхности главным нейтрализующим эпитопом HBsAg (137-147). Литература:
1. Филатов Ф.П. Экспозиционные (кассетные) векторы как подход к конструированию антигенных препаратов. // Успехи Соврем. Биолог. 1991, т. 111, с. 416-428. 2. Francis M.J., Hactings G.Z., Brown A.L., Grace K.G., Rowlands D.J., Brown F. , Clarke B.E. Immunological properties of hepatitis B core antigen fusion proteins. // Proc.Natl. Acad.Sci. USA. -1990. -V.87. -P2545-2549. 3. Грен Э.Я. Пумпен П.П. Рекомбинантные вирусные капсиды — новое поколение иммуногенных белков. // ЖВХО. 1988, т.33, 531-536. 4. Milich D.R., McLachlan A., Moriarty A., Thornton G.B. Immune response to hepatitis B virus core antigen (HBcAg): localization of T cell recognition sites within HBcAg/HBeAg.// J. Immunol. -1987. V.139. -P1223-1231. 5. Борисова Г.П., Берзинь И.Г., Цибиногин В.В., Лосева В.Я., Пушко П.М., Осе В.П., Дрейлиня Д.Э., Грен Э.Я. Кор-антиген вируса гепатита B в качестве носителя функционально активных эпитопов: экспонирование preS-участков на капсидах.// Доклады АН СССР, 1990, т.312, N 3, с.751-754. 6. Yoshikawa A., Tanaka T., Hochi Y., Kato N., Tachibana R., Iizuka H., Machida A. , Okamoto H., Yamasaki M., Miyakawa Y., Mayumi M. Chimeric Hepatitis B Virus Core particles with parts or copies of the Hepatitis C virus core protein.// J.Virol. -1993. -V.67. -P.6064-6070. 7. Schodel F. , Milich D. R. , Will H. Hepatitis B virus nucleocapsid/pre-S2 fusion proteins expressed in attenuated Salmonella for oral vaccination.// J. Immunol. — 1990. -V.145, N12. -P.4317-4321. 8. Авторское свидетельство СССР N 1713930, кл. C 12 N 15/51 опубл. БИ N 7 от 23.02.92. 9. Waters J.A., Brown S.E., Steward M.W., Howard C.R., Thomas H.C. Analysis of the antigenic epitopes of hepatitis B surface antigen involved in induction of a protective antibody response. // Virus Research-1991. -V.22. -P.1-12. 10. Патент РФ N 1651555, кл. C 12 N 15/51, опубл. БИ N 10 от 30.05.94. 11. Zoller M. J., Smith M. Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. In:Meth.Enzymol./Wu R., Grossman L., Moldave K., eds. N.Y., London: Acad.Press. -1983. -V.100. -P.468-500. 12. Vierra J., Messing J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with systhetic universal primers. //Gene. -1982. -V.19. -P259-265. 13. Brosius J. Toxicity of an overproduced foreign gene product in E. coli and use in plasmid vectors for the selection.// Gene. 1984. -V.27. -P. 161-169. 14. Sanger F., Coulson A.R., Barrel B.G. Cloning in singlestranded bacteriophage as an to rapid DNA sequensing.//J.Mol. -1980. -V.143. -P161-178.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pKHBc-33, содержащая ген корового антигена вируса гепатита B, включающего последовательность главного нейтрализующего эпитопа поверхностного антигена вируса гепатита B (137 — 147), мол.м. 3,65 МDа и размером 5523 п.о., содержащая плазмидный векор pKK223-3 размером 4585 п. о., раскрытый по EcoR1-сайту и содержащий сайт инициации репликации плазмиды pBR 322, промотор Ptac и уникальные сайты рестрикции с соответствующими координатами 144, 1948, 3617 и 4584; BAM H1 — фрагмент ДНК плазмиды p 7,5С размером 890 п.о., содержащий ген корового антигена вируса гепатита B с уникальным сайтом рестрикции Xho 1 в положении 242 от начала данного гена; синтетический EcoR1-BamH1-адаптор; синтетический фрагмент, кодирующий последовательность главного нейтрализующего эпитопа поверхностного антигена вируса гепатита B (137-147); Bla-ген (ген бета-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli (генетический маркер). 2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-6955 — продуцент корового антигена вируса гепатита B с экспонироанным на его поверхности главным нейтрализующим эпитопом поверхностного антигена вируса гепатита B (137-147).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3 Source: findpatent.ru