Серологический анализ при вирусном гепатите
Серологические методы исследования
В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела.
Метод обнаружения с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого .
В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, соответствующих применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых.
Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой вначале заболевания (3-7 день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и более повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.
С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (JgM и JgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.
При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентом в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М (JgM). Лишь позднее, на 8-12-й день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G (JgG). При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (JgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеинов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется.
Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, т. е. одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например вирус гепатита С.
ПЦР — это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.
- Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:
- возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в том числе и в материале, получаемом при биопсии;
- возможна диагностика инфекционных болезней на самых разных стадиях заболевания;
- возможность количественной оценки результатов исследований ( сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
- высокая чувствительность метода.
Исследования вирусов гепатита
В настоящее время выделяют следующие формы вирусных гепатитов: гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, гепатит G и гепатит ТТ. Для диагностики каждой из перечисленных форм вирусных гепатитов используется определенный перечень маркеров.
Вирусный гепатит А
Гепатит А — острая энтеровирусная инфекция. Возбудитель — вирус гепатита А (ВГА,HAV) — энтеровирус типа 72. Геном вируса представлен однонитчатой РНК. Вирус гепатита А содержит единственный антиген (HA-Ag). Удельный вес гепатита А в суммарной заболеваемости вирусными гепатитами составляет 70-80%. В структуре заболеваемости гепатитом А дети составляют до 80%, причем основная масса — дошкольники и школьники начальных классов.
ИФА и ПЦР исследования при гепатите А
Вирусный гепатит В
Гепатит В – вирусная антропонозная инфекция. Возбудитель вирус гепатита В (ВГВ, HBV) – относится к семейству гепаднавирусов, ДНК-содержащих вирусов, поражающих клетки печени. Вирионы ВГВ имеют наружную липопротеидную оболочку и нуклеокапсид, содержащий двунитчатую ДНК и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу.
- В структуре ВГВ (HBV) выделяют следующие антигенные системы:
- поверхностный («австралийский») антиген, HBsAg, находящийся в составе липопротеидной оболочки ВГВ, является маркером ВГВ, указывая на инфицированность вирусом;
- ядерный (core), HBcAg – обнаруживается в составе нуклеокапсида вирионов, свидетельствует об активной репродукции вируса;
- HBeAg – входит в состав ядра ВГВ, указывая на активность вируса и, кроме того, на его высокую вирулентность и инфицированность;
- HBxAg – расположен вблизи оболочки вириона, его роль в генезе инфекции изучается.
В диагностике вирусного гепатита В ведущее значение имеет определение комплекса маркеров гепатита. Свыше 5% населения планеты охвачено этой инфекцией, а частота безжелтушных форм ВГВ составляет, по данным разных авторов, от 60 до 82%.
ИФА и ПЦР исследования при диагностике вируса гепатита В
Вирус гепатита С, генотипы
Гепатит С (ВГС) – вирусное заболевание, наиболее часто протекающее в виде посттрансфузионного гепатита с преобладанием безжелтушных и легких форм и склонное к хронизации процесса.
Возбудитель — вирус гепатита С – имеет сходство с флавовирусами, содержит РНК. На основе филогенетического анализа выделено 6 генотипов ВГС и более 80 субтипов.
Генотип 1 — наиболее распространенный генотип во всем мире (от 40 до 80%). Генотип 1а является доминирующим для США, а 1b преобладает в Западной Европе и Южной Азии.
Генотип 2 распространен во всем мире, однако встречается с меньшей частотой, чем генотип 1 (от 10 до 40%).
ВГС тип 3 характерен для Индии, Пакистана, Австралии и Шотландии. Генотип 4 распространен преимущественно в Средней Азии и Египте, генотип 5 – в Южной Африке, а генотип 6 – в Гонконге и Мокао.
Примерно 90% всех случаев посттрансфузионных гепатитов связано с ВГС. Среди доноров антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) обнаруживают в 0,2-5% случаев.
У 40-75% пациентов регистрируется бессимптомная форма болезни, у 50-75% больных острым ВГС формируется хронический гепатит, у 20% из них развивается цирроз печени. Важная роль ВГС отводится и в этиологии гепатоклеточной карциномы.
Геном вируса гепатита С представлен одноцепочечной положительно заряженной РНК, которая кодирует 3 структурных и 5 неструктурных белков. К каждому из этих белков вырабатываются антитела, обнаруживаемые в крови больных гепатитом С.
Отличительной чертой ВГС является волнообразное течение заболевания, в котором разграничивают 3 фазы: острую, латентную и фазу реактивации.
Для острой фазы характерно повышение активности печеночных ферментов в сыворотке крови, уровня антител класса IgM и IgG к ВГС с нарастанием титров, а также РНК ВГС.
Латентная фаза характеризуется отсутствием клинических проявлений, наличием в крови антител класса IgG к ВГС в высоких титрах, отсутствием антител класса IgM и РНК ВГС либо их присутствием в низких концентрациях на фоне незначительного повышения активности печеночных ферментов в периоды обострения.
Для фазы реактивации характерно появление клинических признаков, повышение активности печеночных ферментов, наличие антител класса IgG (к нуклеокапсидному белку core и неструктурным белкам NS) в высоких титрах, присутствие РНК ВГС и нарастание титров антител класса IgM к ВГС в динамике.
ИФА и ПЦР исследования на вирус гепатита С, определение генотипа
Вирусный гепатит D
Гепатит D – вирусная инфекция, вследствие биологических особенностей вируса протекающая исключительно в виде ко- или суперифекции при гепатите В, характеризующаяся тяжелым течением,
часто неблагоприятным исходом.
Самостоятельно, без вируса В, вирус гепатита D не может попасть в организм человека
Возбудитель – вирус гепатита D (ВГD), по своим биологическим свойствам приближается к вироидам – обнаруженным молекулам нуклеиновых кислот. Печень человека – единственное место размножения (репликации) ВГD.
Известно существование двух вариантов инфекции: коинфекция (одновременное заражение ВГВ и ВГD) и суперинфекция (заражение HBsAg-позитивных пациентов). Сочетание ВГВ и ВГD сопровождается развитием более тяжелых форм патологического процесса, что определяется главным образом действием ВГD.
Летальность при суперинфекции достигает 15-20%. Инфицирование дельта-вирусом может вызывать острое заболевание, заканчивающееся выздоровлением, или формировать хроническое носительство ВГD.
При гепатите D могут отсутствовать в крови маркеры гепатита В – анти НВс и НВs-антиген – и наблюдается угнетение ДНК-полимеразной активности, так как ВГD ингибирует репликацию вируса гепатита В.
ИФА и ПЦР исследования на вирус гепатита D
Источник
Диагностика HCV– поэтапный процесс, требующий всестороннего обследования пациента и проведения нескольких тестов. Но подтверждение заболевания происходит только в том случае, если обнаружены маркеры гепатита С. Это показатели лабораторных исследований, которые однозначно указывают на наличие вирусной инфекции.
Из-за особенностей проведения анализов, точный диагноз невозможно поставить на основании одного теста. Для получения полной клинической картины следует не только выявить специфические показатели, появляющиеся при инфицировании гепатитом С. Существует и ряд других признаков, которые служат дополнительным подтверждением наличия патологии.
Что означает положительные маркеры гепатита С
Гепатит С – вирусное заболевание, избирательно поражающее клетки печени. В медицинской литературе чаще обозначается по русской или английской аббревиатуре – ВГС или HCV соответственно. Инфицирование провоцирует ряд изменений: начинается выработка иммуноглобулинов (их структура строго специфична в соответствии с протеиновым строением антигенов гепатита С), в плазме появляется патогенная РНК вируса, изменяется уровень форменных элементов крови, нарушается функционирование печени.
Подобные процессы не могут не отражаться на картине лабораторных показателей. Что значит маркеры гепатита С? Это основные параметры, играющие роль в диагностике острой и хронической формы HCV.
| Прямые и косвенные маркеры гепатита C | Описание |
| Серологические показатели | Спектр серологических исследований включает следующие анализы:
|
| Молекулярные показатели | Как правило, для выполнения исследований пользуются методикой ПЦР. Тесты проводят всем пациентам:
|
| Косвенные показатели вирусного гепатита С | Иногда подозрения на HCV возникают при расшифровке некоторых общеклинических исследований. На инфицирование может указывать:
|
При расшифровке и определении, что означает тот или иной показатель анализов крови, принимают во внимание общую клиническую картину и наличие других заболеваний.
Большую роль играет:
- самочувствие человека (на гепатит Ц может указывать слабость, сонливость, субфебрильная температура, разнообразные нарушения пищеварения);
- наличие аутоиммунных расстройств;
- состояние иммунной системы;
- прием лекарств, влияющих на резистентность к инфекциям, на работу печени.
Помимо результатов анализов крови, учитываются данные инструментального диагностического обследования.
При оценке общего состояния больного важна:
- информация, полученная в ходе ультразвукового осмотра органов брюшной полости (при гепатите С обычно изменены размеры, а также очертания печени);
- данные процедуры «Фиброскан» (могут обнаруживаться очаги соединительной ткани, в зависимости от их размеров устанавливают степень фиброза печени либо подтверждают его отсутствие);
- данные томографии (процедура дает представление о структуре паренхимы печени, позволяет обнаружить очаги злокачественной малигнизации клеток);
- результаты гистологии после малоинвазивной пункционной биопсии печени (микроскопическое исследование образца тканей не может выявить вирусные частицы, но предоставляет информацию о наличии и тяжести цирроза, установить тип опухоли при ее наличии).
Многие пациенты интересуются, сколько маркеров учитываются при постановке диагноза острого либо хронического типа HCV. Ключевую роль играют параметры ИФА (серологические маркеры вирусных гепатитов) и ПЦР. Остальные показатели имеют вспомогательное значение для оценки общего состояния пациентов, определения стратегии терапии и последующей реабилитации.
Положительные маркеры вирусного поражения печени HCV – это специфические лабораторные показатели, которые позволяют однозначно подтвердить наличие возбудителя гепатита С в организме. Но выявление подобных параметров не освобождает от необходимости проведения дальнейшего обследования.
Какие лабораторные тесты указывают на инфицирование
В целом все виды диагностических тестов можно разделить на лабораторные и инструментальные. Первые включают исследования биологических жидкостей: крови, мочи, кала, спермы, слюны, желудочного секрета, желчи, биоптатов тканей. Инструментальные проводят при помощи специального медицинского оборудования (ультразвуковых сканеров, томографов, рентгена, эндоскопов). При подозрении на гепатит С выполняются и лабораторные, и инструментальные тесты.
Специфические для HCV маркеры определяются только при анализе крови.
Основные разновидности тестов, применяемых в протоколах диагностики гепатита С, перечислены в таблице.
| Виды клинических исследований | Описание проводимого анализа, показания к выполнению и другие особенности |
| Иммуноферментный анализ | Помогает определить серологические маркеры HCV. Методом ИФА можно определить (в зависимости от вида тест-системы):
Положительные маркеры ИФА требуют дальнейшего подтверждения |
| Полимеразная цепная реакция | По методике ПЦР проводят три исследования:
|
Прочие тесты (биохимия крови, общеклинические исследования, печеночные пробы) являются лишь вспомогательными.
Целью их проведения служит:
- определение степени поражения печени;
- оценка риска развития осложнений;
- выявление возможных сопутствующих заболеваний, которые могут прямо или косвенно повлиять на ход лечения (аутоиммунные патологии, онкологические новообразования, нарушения функции почек, кардиоваскулярные расстройства);
- выявление скрытых, латентно протекающих системных инфекций (ВИЧ, туберкулеза, хронического пиелонефрита, гломерулонефрита).
При сомнительных или положительных результатах дальнейшим ведением пациента должен заниматься врач. Только специалист может грамотно расшифровать анализы, а затем составить схему обследования. К этапу лечения можно переходить, когда определены основные маркеры гепатита C и выполнены дополнительные тесты.
Подготовка к исследованиям
Для получения достоверных результатов важно соблюдать все правила, как сдавать кровь. Негативное влияние на печень из-за неправильной диеты, употребления спиртных напитков и воздействия других факторов может исказить результаты тестирования. Основное требование – это соответствующая диета.
Принципы режима питания, которые нужно соблюдать как минимум за 5 дней до исследования, состоят в следующем:
- Не есть жирные сорта мяса, рыбы, птицы. Их заменяют нежирной морской и речной рыбой, говядиной, индейкой, курицей, кроликом.
- Ограничить употребление молока, кисломолочных продуктов с высоким процентом жирности. Разрешены нежирные йогурты, кефир, молоко, творог.
- Исключается сдоба, любые кондитерские изделия, содержащие какао продукты. Из хлебобулочных изделий разрешены лаваши, черный хлеб.
- Категорически запрещены любые алкогольные напитки.
- Не пить сладкую газировку, энергетики.
- Исключается фастфуд и колбасные изделия.
При приготовлении блюд руководствуются следующими рекомендациями:
- нужно обязательно следить за качеством приобретаемых продуктов питания;
- мясо, рыбу, птицу нужно употреблять в отварном или тушеном виде, разрешены блюда из фарша – котлеты (паровые), тефтели, суфле;
- каши и другие гарниры можно готовить с использованием растительного масла;
- разрешены бутерброды с маслом и сыром (через день во время завтрака или обеда, но не чаще 1 раза в сутки).
Диету нужно соблюдать не только перед анализами, но и до получения результатов и их расшифровки. При подтверждении диагноза гепатита С таким принципам питания следуют до восстановления печени.
Другие правила подготовки:
- сдавать кровь натощак;
- за несколько часов до посещения клиники нельзя курить;
- за 1–2 дня ограничить физические нагрузки (это не означает постельный режим, но от посещения тренировки или спортивного зала лучше отказаться).
При выборе клиники, где сдать кровь на маркеры гепатита С, можно руководствоваться несколькими критериями. Обследование проводят бесплатно (при наличии полиса ОМС и направления от терапевта) в поликлинике по месту жительства. Чтобы не ждать в очереди, некоторые пациенты предпочитают частные лаборатории. В таком случае документов от доктора не требуется, достаточно факта оплаты и личных данных. Последний способ удобнее и в плане получения результатов. Сейчас не обязательно повторно посещать лабораторию – бланк отправят по оставленному электронному адресу.
Сколько ждать результатов, определяют в лаборатории. Обычно этот срок не превышает 3 дней. Средняя стоимость анализов зависит от региона. Например, для Москвы цена исследования ИФА составляет около 500 рублей.
Диагностика маркеров
Диагностика гепатита С начинается со следующих маркеров: ИФА и ПЦР. Иммуноферментный анализ относят к группе рутинных и проводится как при подозрении на HCV, так и при профилактической диспансеризации. Как правило, назначают тест anti-HCV Тотал, определяющий общее количество антител без их дифференцировки на классы. В дальнейшем требуется проведение дифференцированного исследования, в ходе которого отдельно устанавливают титр иммуноглобулинов типа G и класса М.
Более расширенный анализ на серологические маркеры HCV (определение антигенов) выполняется по строгим показаниям из-за сложностей и дороговизны проведения обследования.
Следующий этап диагностики – полимеразная цепная реакция (ПЦР). Основной маркер наличия вируса – позитивный результат качественного теста. Обнаружение частиц патогена в плазме свидетельствует о заражении, дальнейшие тесты направлены на определение тяжести и активности вирусного патологического процесса.
К числу обязательных относят исследования, которые на первый взгляд не имеют отношения к поражению печени. Но результат этих тестов необходим для определения хода лечения и предупреждения возможных осложнений терапии, определения противопоказаний.
Так, нужно сдать кровь на:
- ВИЧ;
- иммунограмму;
- коагулограмму;
- биохимию;
- печеночные пробы;
- венерические заболевания;
- другие формы вирусных гепатитов (особенно, HBV);
- туберкулез;
- беременность (для женщин детородного возраста).
Но ход диагностического процесса иногда корректируют в зависимости от особенностей пациента. Например, получение ложных результатов ИФА возможно при:
- беременности;
- иммунодефиците (любой этиологии, в том числе вызванном приемом лекарств);
- онкологических заболеваниях;
- аутоиммунных процессах;
- тяжелых системных инфекциях;
- перенесенном HCV;
- у детей, рожденных у инфицированных матерей (до 3–5 лет).
При беременности проводят ИФА, но предупреждают женщину о возможности ложноположительных результатов. У остальных категорий пациентов серологическое исследование всегда выполняют вместе с качественной ПЦР. Косвенным признаком гепатита С, требующим ИФА, служит повышение уровня печеночных ферментов, билирубина и явные клинические признаки поражения печени.
С учетом роста количества выявленных случаев инфицирования тестирование на маркеры HCV рекомендуют проводить ежегодно всем людям старше 18 лет. Но в особую группу риска попадают работники здравоохранения, зараженные ВИЧ, посетители сомнительных нелицензированных салонов красоты, мастеров, выполняющих пирсинг и тату, перманентный макияж, занимающихся мезотерапией. Также регулярное обследование требуется мужчинам и женщинам, ведущим беспорядочную половую жизнь, особенно если были случаи незащищенных сексуальных контактов.
Расшифровка серологических маркеров
Несмотря на то, что практически все современные лаборатории в бланке указывают референсные значения, интерпретацию результатов всех исследований лучше доверить врачу. В целом, расшифровка серологических маркеров на гепатит С и данных ПЦР приведена в таблице ниже.
| Полученные результаты | Возможная расшифровка (но конечные выводы должен делать только врач) |
| Позитивный тест на общие антитела | Является одним из маркеров HCV, но для исключения ложноположительного и ложноотрицательного результатов требуется подтверждение ПЦР |
| Негативный тест на общие антитела | Исследование демонстрирует, что человек не инфицирован. Но такой результат можно получить, если заражение произошло менее 4–6 недель назад или при ослабленной иммунной системе |
| Обнаружение IgG | Это один из маркеров носителя гепатита С, то есть проявляется при скрытом течении инфекции и отсутствии прогрессирования процесса. Также свидетельствует о хронической форме патологии. Но может обнаруживаться на протяжении многих лет после выздоровления |
| Выявление IgМ | Маркер острого вирусного процесса |
| Выявление core-антигена | Служит более сложным в выполнении аналогом качественной ПЦР, подтверждает инфицирование |
| Положительная качественная ПЦР | Один из основных маркеров патологии, однозначно свидетельствует о наличии заболевания |
Бывает, что анализ на РНК отрицательный, а маркеры положительные. То есть в крови пациента были обнаружены антитела к HCV, но последующая качественная ПЦР продемонстрировала негативный результат.
Как правило, подобная ситуация – следствие ложноположительного ИФА, и человек, скорее всего, здоров. Но для исключения латентной инфекции тесты на обнаружение маркеров вируса проводят еще несколько раз с интервалом в 4–5 месяцев. Дополнительно необходимо точно установить причину ошибочного ИФА.
Источник
