Скрининг донорской крови на гепатит в и с

Минипул-NAT-скрининг донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В и С

Н.А. Фёдоров, А.А. Ёлов, Е.Г. Черкасов, Е.Б. Жибурт

Центр крови Минздрава России, Москва

1. Введение.

ИФА- скрининг донорской крови на маркеры ВИЧ, HCV и HBV является обязательным во всем мире, а в странах Европы, США, Канаде, Японии, Австралии, Новой Зеландии, Сингапуре и Гонконге плазма и кровь дополнительно подвергается NAT- скрининг с целью выбраковки донаций, полученных от доноров, находящихся в периоде «иммунологического окна».

Международный опыт NAT- скрининг донорской крови свидетельствует о том, что после его применения в масштабах всей страны, остаточный риск вирусных инфекций после трансфузий значительно снизился. [1]
Создание международных NAT-стандартов позволило применить для NAT-скрининга крови различные методы, различные приборы и тест-системы, в том числе и «in-house». С началом производства международных NAT- стандартов во всем мире снята зависимость NAT- диагностики от дорогостоящих коммерческих тест-систем, так как можно объективно гарантировать чувствительность обнаружения любого патогена в данной лаборатории и в данное время при использовании любых приборов и тест-систем, в том числе и произведённых «in-house». [2]

ПЦР — это один из методов лабораторной молекулярной диагностики, и он может и должен быть представлен в любой большой клинико-диагностической лаборатории, наряду, с ИФА, биохимическими, цитологическими, культуральными и различными физико-химическими методами. В настоящее время широкое распространение получила ИФА-диагностика, в том числе и в службе крови. ИФА-лаборатория без особых усилий может разместить комплект небольших NAT-диагностических приборов. Генамплификационные (NAT) методы диагностики совместимы с другими диагностическими исследованиями, например, с ИФА, биохимическими, цитологическими, бактериологическими и другими, если используется тот же самый материал для исследования. [3]

2. Формирование минипулов для NAT-скринирования донорской крови.

В подавляющем большинстве случаев минипулы для NAT-скринирования донорской крови создают в формате 96-луночного микропланшета, используя автоматические самплеры Tecan, Hamilton и другие. Из аликвот сыворотки или плазмы по 100 мкл формируют минипулы из 8 (по вертикали планшета) и из 12 (по горизонтали планшета) донаций. Из пулов по 8 или 12 донаций создают пулы из 48 или 96 донаций.

При отсутствии автоматического самплера эти операции можно производить вручную, используя автоматические пипетки с отдельными для каждой донации одноразовыми наконечниками.

Перед стадией экстракции РНК и ДНК из полученных пулов, особенно из пулов по 48 и 96 донаций, для снятия эффекта разбавления вирус-содержащей донации эти пулы необходимо центрифугировать при 48 000 g 1 час, при этом вирусы концентрируются в образующемся плотном осадке на дне пробирки. При отсутствии такой возможности следует использовать пулы из 8 или 12 донаций.

3. Экстрация нуклеиновых кислот.

Для экстракции нуклеиновых кислот предпочтительно применять однопробирочный метод, одновременно экстрагируя РНК и ДНК, используя лизис с последующим осаждением. [1, 4] К полученному сухому осадку следует немедленно добавить реагенты для обратной транскрипции с последующей инкубацией 20 мин при 420 для перевода быстроразрушающейся вирусной РНК в кДНК. [1, 5] Полученный раствор подвергают ПЦР-анализу на все три вируса в соответствии с инструкцией к набору [1].

4. Амплификация полученных специфических вирусных ДНК и кДНК.

На основе нашего большого опыта рекомендуется использовать двухрастворную компоновку реагентов для ПЦР-анализа, которая состоит из раствора для ПЦР, содержащего трифосфаты, внутренний стандарт и праймеры и раствора Taq-полимеразы в двукратном буфере для ПЦР. [1, 5] ПЦР-амплификацию проводят в программируемом температурном режиме с обязательным включением 1-2 негативных контролей (не содержащих ДНК и кДНК) и положительных контролей (международных, национальных или лабораторных) в двух-трех разведениях в соответствии с инструкцией к набору. [1]

5. Электрофоретическая и флюоресцентная детекция специфического ПЦР-продукта (амплифицированной ДНК).

Детекция продуктов ПЦР проводится методом гель-электрофореза, позволяющего раздельно обнаруживать сигналы вирусов и внутреннего стандарта (Рис. 1). При наличии соответствующей аппаратуры и реагентов возможна флюоресцентная детекция продуктов ПЦР в закрытой пробирке, исключающей ложноположительные результаты, обусловленные продуктами ПЦР.

Рис. 1 Схематическое изображение возможных электрофоретических полос (сигналов) амплификонов HIV,HBV и HCV и внутреннего стандарта (ВС), получаемых при ПЦР-детекции их в сыворотке или плазме крови.

1-5 — Сыворотки доноров или больных,
6-7 — Положительные контроли,

8-9 — Отрицательные контроли

Оценка результатов:

1. Сигналы отсутствуют: реакция не прошла.

2. Виден только сигнал внутреннего стандарта: вируса в крови нет.

3. Виден только сигнал амплификона вируса: концентрация вируса в крови высокая, поэтому сигнал ВС не виден.

4. Видны сигналы внутреннего стандарта и HBV: вирус в крови есть, но концентрация его низкая.

5. Видны слабый сигнал амплификона вируса и более сильный сигнал ВС: необходим повторный анализ.

6. 7. Положительные контрольные пробы прошли нормально.

8. Виден только сигнал ВС в пробе отрицательного контроля: реакция прошла нормально.

9. В пробе отрицательного контроля видны сигналы ВС и амплификона вируса: ложноположительный результат.

Заключение:

Внедрение NAT- тестирования донорской крови — веление времени. С той или иной частотой, в разных странах выявляют доноров с виремией, но без серологических признаков гемотрансмиссивной инфекции.

Частота NAT-позитивных ИФА-негативных доноров в центре крови Сакраменто (США) составляет для ВГС — 1:169500, для ВИЧ — 1:566328 [Holland P.V., Aceituno S., 2003].

Во Франции этот показатель — для ВГС — 1:3187562, для ВИЧ — 1:1594000 [Assal A. et al., 2003].

В Германии — для ВГС — 1:1411183, для ВИЧ — 1:5455831, для ВГВ — 1:430854 [Seifried E., Roth W.K., 2003].

Следует отметить, что распространенность маркеров инфекций среди потенциальных доноров в развитых и развивающихся странах отличается в 10 — 1000 раз [Allain J.-P. et al., 2003].
Ведущие центры крови, предприятия по производству препаратов крови России могут и должны внедрять генодиагностические технологии — в интересах повышения безопасности гемотрансфузионной терапии.

6. Литература.

1. Генамплификационное (NAT) тестирование крови и других материалов на патогены и мутации. Н. А. Фёдоров, А.А. Ёлов, Ю.С. Суханов, Е.Б. Жибурт — Москва, 2003.

2. NAT-минипул геноскринирование крови на основе международных стандартов — гарантия вирусной и бактериальной безопасности реципиентов. Российско-немецкий научно-методический сборник. — Москва-Новосибирск-Франкфурт-на-Майне, 2003.

3. Информационное письмо «Необязательные и обязательные требования к генамплификационному (NAT) тестированию крови и других клинических материалов на вирусные и бактериальные патогены» Н.А. Фёдоров, Вестник службы крови России, № 2, с. 33, июнь 2003

4. Патент на изобретение № 2134871 «Способ подготовки биологического материала для ПЦР генамплификационной диагностики» Н.А. Фёдоров, А.А. Ёлов, Ю.С. Суханов — Приоритет от 01.12.1998, Москва.

5. Патент на изобретение № 2164532 «Способы и наборы реагентов для генамплификационной диагностики методами ПЦР и РНК-ПЦР» Н.А. Фёдоров, А.А. Ёлов, Ю.С. Суханов — Приоритет от 11.07.2000, Москва.

Сокращения:

ИФА — иммуноферментный анализ

NAT — nucleic acid amplification technologies

ПЦР — полимеразная цепная реакция

На главную