Способ моделирования цирроза печени
Изобретение относится к экспериментальной медицине и фармакологии и может быть использовано для изучения токсических поражений печени в доклиническом исследовании гепатозащитных препаратов и в разработке новых способов лечения цирроза печени. Способ представляет собой введение в желудок лабораторного животного два раза в неделю в течение месяца 50%-ного раствора совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и 10%-ного раствора этанола вместо воды для питья. Способ позволяет повысить воспроизводимость и упростить способ, сократить срок моделирования цирроза печени и приблизить к клиническому течению данной патологии. 4 табл.
Изобретение относится к экспериментальной медицине и фармакологии, может быть использовано для изучения токсических поражений печени, в доклиническом исследовании гепатозащитных препаратов и в разработке новых способов лечения данной патологии.
Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению является способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих (см. а. с. 94026117, G 09 В 23/28, БИ 24, 1996), где в качестве химического вещества берут формалин и вводят его путем вдыхания воздуха, содержащего 17,5-18,5 мг/л формалина.
Известный способ моделирования цирроза печени является продолжительным и трудоемким: ежедневные ингаляционные опыты в течение 7 месяцев. Кроме того, 70%-ный раствор формалина представляет собой водный раствор формальдегида, который обладает резко выраженным раздражающим и сенсибилизирующим действием, средняя смертельная концентрация для крыс 588 мг/м3. Предельно допустимая концентрация паров формальдегида в воздухе рабочей зоны 0,5 мг/м3, 2 класс опасности. Вещество остронаправленного механизма действия, способное вызывать аллергические заболевания в условиях производства и требующее автоматического контроля за его содержанием в воздухе.
При концентрации формалина 17,5-18,5 мг/л (или 17500-18500 мг/м3) возможно развитие острого отравления всего организма с воспалительными и некробиотическими изменениями слизистых оболочек верхних дыхательных путей и легких.
В условиях производства хроническое воздействие высоких концентраций формалина недопустимо.
Техническим результатом изобретения является повышение воспроизводимости и упрощение способа, сокращение сроков моделирования цирроза печени и приближение к клиническому течению данной патологии печени.
Технический результат достигается тем, что в желудок лабораторного животного 2 раза в неделю в течение месяца вводят 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и ежедневно в течение месяца вместо воды для питья дают 10%-ный раствор этанола.
Для определения кратности введения 50%-ного раствора совтола-1 на оливковом масле и его количества для моделирования цирроза печени был проведен эксперимент на животных, полученные данные сведены в табл. 1.
Одновременно в течение всего эксперимента животным давали вместо воды 10%-ный раствор этанола.
Из таблицы 1 видно, что при кратности введения 50%-ного раствора совтола-1 на оливковом масле два раза в неделю воспроизводится надежная модель цирроза печени без гибели животных.
Повышение воспроизводимости формирования хронического патологического процесса в печени и сокращения сроков опыта достигается при использовании совтола-1 и 10%-ного этанола в качестве питья вместо воды, за счет потенцирования гепатотоксического эффекта. Экспериментальный цирроз печени подтвержден морфогистохимическими и биохимическими показателями.
Способ моделирования цирроза печени осуществляется следующим образом.
Лабораторному животному два раза в неделю в течение месяца вводят в желудок зондом 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела.
На протяжении всего эксперимента ежедневно для питья дают 10%-ный раствор этанола.
Готовят: 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 1 часть совтола-1 и 2 части оливкового масла, перемешивают и вводят в желудок зондом, а 10%-ный раствор этанола для питья готовят путем разведения 96o этилового спирта.
ПРИМЕР . Крысе, 180 г, 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле вводился из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела дважды в неделю в течение одного месяца, на протяжении эксперимента для питья животному давали 10%-ный раствор этанола.
В течение всего опыта не отмечено каких-либо изменений внешнего вида и поведения животного, кроме частичного отказа от пищи.
По истечении одного месяца проведена декапитация животного. Морфогистохимический анализ кусочков печени показал развитие хронического патологического процесса, основным проявлением которого является цирроз печени.
Это подтверждается увеличением относительной массы печени и развитием в печеночной паренхиме фиброза и цитолиза. На гистологических препаратах печени поля фиброза занимают 3,1% среза, у интактной крысы на долю соединительной ткани приходится 0,5%. Гепатоциты локализованы преимущественно в перипортальной зоне, находятся в состоянии белковой и жировой дистрофии. Определяется дискомплектация печеночных балок, пролиферация соединительной ткани в портальных трактах с проникновением фиброзных тяжей в глубь долек. В поле зрения большое количество некротизированных гепатоцитов, отек и разрыхление стремы, в клеточном инфильтрате наблюдаются лимфоциты.
При морфометрии препаратов печени выявлено снижение ядерноцитоплазматического отношения, отклонения стромы к паренхиме (см. табл.2).
Гистохимический анализ ткани печени показал увеличение активности кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы и снижение активности АТФазы.
Экспериментальный цирроз печени подтверждается также изменениями биохимических показателей: увеличением содержания изолированных двойных связей, диеновых коньюгатов, триеновых конъюгатов, глюкозоаминогликанов в ткани печени (см. табл.3).
Кроме того, наблюдается увеличение количества оксипролина во фракциях коллагена кислоторастворимого и кислотоустойчивого.
В сыворотке крови выявлено повышение активности ферментов: аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы.
Предлагаемым способом воспроизводится надежная модель цирроза печени, что подтверждено морфогистохимическим анализом печени и биохимическими показателями. Модель позволяет изучать тяжелый хронический процесс в печени в динамике его развития.
Предлагаемый способ моделирования цирроза печени в сравнении с известным (см. табл. 4) позволяет повысить воспроизводимость моделирования при сокращенных сроках опыта и в более упрощенном виде приблизиться к клиническому течению цирроза печени вследствие развития необратимых структурных и функциональных изменений в гепатоцитах, что подтверждено морфогистохимическим анализом, биохимическими показателями и оценкой поведения животных.
Формула изобретения
Способ моделирования цирроза печени путем введения химических веществ лабораторному животному, отличающийся тем, что в желудок вводят два раза в неделю в течение месяца 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и 10%-ный раствор этанола вместо воды для питья.
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4
Источник
Изобретение относится к методам моделирования заболеваний печени. Одновременно пережимают по меньшей мере четыре сосудистые ножки долей печени в течение не более 40 мин. Способ позволяет эффективно моделировать цирроз печени. 3 ил.
Изобретение относится к медицине, в частности к методам моделирования заболеваний печени, и может найти широкое применение при моделировании цирроза печени.
Моделирование заболеваний печени — достаточно сложная задача, во-первых, из-за многообразия ее функций, имеющих жизненно важное значение для организма, во-вторых, из-за особенностей ее васкуляризации, представленной двумя самостоятельными системами — воротной вены и печеночной артерии.
Известен способ моделирования цирроза печени длительным введением малых доз гепатотропных ядов, например ССl4.
При введении биологическим объектам два раза в неделю по 3-5 мл раствора ССl4 цирроз развивается через шесть месяцев.
Для ускорения получения модели цирроза введение гепатотропных ядов сочетают с дополнительной инъекцией бактерий или перевязкой или сужением общего желчного протока.
Процесс формирования цирроза печени начинается через 1,5-2 месяца от начала эксперимента, а спустя 3-4 месяца патологический процесс выражен достаточно отчетливо (см. кн. С.А. Шалимова и др. «Руководство по экспериментальной хирургии», М.: Медицина, 1989г., стр. 186-187).
Однако данные способы имеют существенные недостатки — трудность при моделировании цирроза печени и длительность эксперимента.
Учитывая данные недостатки на практике чаще воспроизводят один из ведущих синдромов цирроза печени — портальную гипертензию, что требует меньше времени и усилий.
Различают портальную гипертензию, возникающую при внепеченочном блоке воротной вены, внутрипеченочном блоке и затруднении оттока по печеночным венам (см. там же стр. 187-188).
Внепеченочный блок, развивающийся при нарушении проходимости основного ствола воротной вены, моделируют, сужая его лигатурой, накладываемой непосредственно у ворот печени, сочетая наложение лигатуры с введением в окружающую клетчатку веществ, вызывающих воспаление, накладывая различные спирали, манжеты и т.д.
Дистрофические повреждения печеночных клеток отмечаются через 3-4 недели. Но при сужении просвета воротной вены более чем на 40-50% возникает прогрессирующая печеночная недостаточность, и животные гибнут спустя 1-2 месяца.
Портальную гипертензию, вызванную внутрипеченочным блоком, воспроизвести труднее всего. Наиболее реальный путь — селективная катетеризация внутрипеченочных разветвлений воротной вены и их эмболизация микросферами.
Однако воспроизводимость патологического процесса в данном случае тоже невелика и составляет 50-55%.
Портальную гипертензию, возникающую из-за нарушения оттока по печеночным венам, моделируют тремя способами:
1) сужением полой вены проксимальнее спадения печеночных вен под диафрагмой или сразу же над ней лигатурой и т.п.; 2) обтурацией устьев печеночных вен полой трубкой, препятствующей оттоку крови от печени или надувного баллончика; полной или частичной окклюзией печеночных вен спиралями типа Тиантурко.
Однако все перечисленные способы трудоемки, длительны и к тому же созданные модели не отвечают полностью реальным условиям клиники.
Известен способ хирургического моделирования цирроза печени, выбранный в качестве ближайшего аналога, предусматривающий частичную резекцию хвостовой, правой латеральной, квадратной долей и сосковидного (папиллярного) отростка, осуществляемую с предварительным наложением лигатур (швов с помощью шелковой нити) на соответствующие сосудистые ножки, позволяющие полностью перекрыть питание этих долей, и затем наложение (временное) сосудистых зажимов на ножки левой и правой медиальной и левой латериальной долей печени на уровне ее ворот в течение не более 60 мин (см. Transplantation, 1998 г. 65, 1433-1436 «A new end simpl technigue…») Yadar SS. Gao W).
Для предотвращения закупоривания брыжейки известный способ предусматривает ее шунтирование.
Продолжительность пережатия сосудистых ножек нерезецированных долей печени, превышающая 60 мин, заканчивалась в большинстве случаев гибелью объекта.
Как видно данный способ хирургического моделирования ишемии печени с последующим возникновением в печени циррозоподобных изменений хирургически сложен, достаточно длителен и также не отвечает полностью реальным условиям клиники, т.е. недостаточно эффективен.
Таким образом, техническим результатом, на решение которого направлено данное изобретение, является упрощение способа моделирования цирроза печени, обеспечение его большей доступности и повышение его эффективности.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе хирургического моделирования цирроза печени, предусматривающем одновременное пережатие сосудистых ножек долей печени, согласно изобретению количество одновременно переживаемых сосудистых ножек долей печени составляет по меньшей мере четыре.
При этом время, в течение которого осуществляют пережатие сосудистых ножек долей печени, составляет не более 40 мин.
Заявителем экспериментально установлено, что именно одновременное пережатие по меньшей мере четырех сосудистых ножек долей печени способствует достижению поставленных перед изобретением технических задач.
Именно пережатие одновременно по меньшей мере четырех сосудистых ножек и именно в течение не более чем 40 мин обеспечивает формирование примерно через 1,5 месяца циррозоподобных изменений в печени, причем полностью удовлетворяющим требованиям эксперимента, исключает гибель экспериментальных животных.
Данный способ значительно проще, чем все известные ранее хирургические способы моделирования цирроза печени, поскольку исключает дополнительные хирургические манипуляции, которые не только более сложны, но и иногда более губительны для животного.
Способ дает стабильные результаты при всех заявляемых количествах пережимаемых ножек, что немаловажно в экспериментальной хирургии.
При этом легко моделируется именно цирроз тех долей печени, сосудистые ножки которых пережимаются.
Таким образом, заявляемый способ достаточно прост и более эффективен в отличие от всех известных способов.
Совокупность существенных признаков заявляемого объекта «способ» имеет отличия от ближайшего аналога и не следует явным образом из изученного уровня техники, что свидетельствует о его соответствии критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Заявляемый способ может найти широкое применение в экспериментальной хирургии, что свидетельствует о его соответствии критерию «промышленная применимость».
Способ осуществляется следующим образом.
В качестве биологических объектов использовались крысы весом 100-300 г. Наркоз осуществлялся интраперитонеальным введением 1 мл 0,25%-ного калипсола на 100 г веса животного.
Биологический объект (крыса) укладывался на операционный стол в положении на спине, передние и задние конечности фиксировались растяжками к специальным державкам. Операционное поле обрабатывалось 70%-ным спиртом.
По белой линии живота проводилось послойное рассечение ножницами кожи и мышц, длина разреза 2,5-3 см.
На марлевую салфетку, смоченную 0,9%-ным раствором хлорида натрия, осторожно извлекались по очереди доли печени, при этом визуализировались их сосудистые ножки (пучки), которые пережимались сосудистыми зажимами в течение не более 40 мин. О нарушении нормального кровотока свидетельствовало резкое побледнение поверхностей долей в первые минуты, а затем их багрово-синюшный цвет.
По истечении указанного времени зажимы снимали, доли печени осторожно укладывали в брюшную полость, рану послойно ушивали.
Животные после операции содержались в виварии в течение 45 дней, после чего некоторых животных забивали. Вскрытие показало, что в прооперированных долях всех вскрытых животных сформировались циррозоподобные изменения.
Пример 1. Биологический объект весом 200 г. Наркоз — 0,25% калипсол. Объект фиксируется на операционном столе. Операционное поле обрабатывается 70%-ным раствором спирта.
Делают послойный разрез 3 см по белой линии живота. Извлекают сначала левую латеральную долю. Визуализированную сосудистую ножку (пучок) левой латеральной доли пережимают сосудистым зажимом. Затем извлекают левую медиальную долю и пережимают сосудистым зажимом ее сосудистую ножку. Затем извлекают правую медиальную долю и, наконец, правую латеральную доли и также пережимают их сосудистые ножки (пучки) сосудистыми зажимами.
О нарушении портального кровотока свидетельствует резкое побледнение поверхностей долей в первые минуты после пережатия, а затем их багрово-синюшный цвет.
Время пережатия сосудистых ножек (пучков) 40 мин. По истечении указанного времени зажимы снимают, доли печени осторожно укладывают в брюшную полость, рану послойно ушивают.
Животное выведенно из эксперимента на 14-е сутки.
Ткань печени фиксируется 10%-ным нейтральным формалином, после стандартной гистологической проводки из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы, которые окрашивают гематоксилином-эозином. Микроскопия осуществлялась с применением увеличения 400х.
На фиг. 1 четкость балочного строения ткани печени нарушена за счет набухания цитоплазмы гепатоцитов. Отмечается выраженная дистрофия гепатоцитов, пролиферация фибробластов.
На фиг. 2 по ходу портальных трактов определяется очаговая инфильтрация макрофагами, лимфоцитами и нейтрофильными лейкоцитами с тенденцией к распространению инфильтратов в периферические отделы долек.
Пример 2. Биологический объект весом 190 г. В отличие от примера 1 в данном примере пережимали сосудистые ножки (пучки) левой латеральной доли, левой медиальной доли, правой латеральной доли, хвостатой доли, правой латеральной доли. Время удержания сосудистых зажимов на сосудистых ножках (пучках) 39 мин. Животное выведено из эксперимента на 45 сутки после проведения операции.
Ткань печени фиксирована 10%-ным нейтральным формалином, после стандартной гистологической проводки из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы, которые окрашивают гематоксилином-эозином, микроскопия осуществлялась с применением увеличения 200х.
Фиг. 3. От портальных трактов в паренхиму печеночной ткани отходят соединительно-тканные прослойки различной толщины и формы вплоть до кольцевидной. Эти прослойки соединяют между собой по два-три портальных тракта или портальные тракты с центральными венами. Гепатоциты имеют различную форму, встречаются двуядерные клетки, выражен полиморфизм ядер: от мелких гиперхромных до крупных просветленных. Диффузная тяжелая гидропическая дистрофия и мелкие рассеянные очаги некробиозов гепатоцитов.
Пример 3. Биологический объект весом 240 г.
Операция осуществлена полностью, как описано в примере 1.
Животное выведено из эксперимента на 45 сутки после проведения операции. Ткань печени фиксирована 10%-ным нейтральным формалином, после стандартной гистологической проводки из парафиновых блоков изготовлены гистологические срезы, которые окрашены гематоксилином-эозином, микроскопия осуществлялась с применением увеличения 400х.
Прослойки соединительной ткани отграничивают в ткани печени ложные дольки. Ложные дольки построены из фрагментов одной дольки и лишены портальных трактов и центральных вен. Признаки диффузной тяжелой гидропической дистрофии и мелкие рассеяные очаги некробиозов гепатоцитов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ хирургического моделирования цирроза печени, предусматривающий одновременное пережатие сосудистых ножек долей печени, отличающийся тем, что количество одновременно пережимаемых сосудистых ножек долей печени составляет по меньшей мере четыре, а время, в течение которого осуществляют пережатие, составляет не более 40 мин.
Источник
