Качественный и количествен анализ пцр гепатита в
Гепатит В – инфекционное заболевание печени, протекающее по аутоиммунному механизму. Вирус, попадая в кровь, размножается в гепатоцитах, вызывает их гибель. В затяжной хронической форме гепатит В вызывает рак и цирроз. По симптоматике заболевание схоже с простудой, выявить его на ранней стадии сложно. После контакта с больным или посещении стран с высокой заболеваемостью, угрозе потенциального заражения проводятся исследования крови. Анализ ПЦР на гепатит B с высокой точностью определяет присутствие вируса, степень активности возбудителя.
Качественная оценка выявляет возбудителя, количественная помогает установить степень вирусной нагрузки. Повторное исследование помогает увидеть клиническую картину течения заболевания в динамике.
Вы знаете как расшифровывается ПЦР?
ДаНет
Что такое ПЦР на гепатит В?
Метод полимеразной реакции (ПЦР) разработан лауреатом нобелевской премии Мюллисом. Он основан на принципе копирования структуры возбудителя. Определяет в крови ДНК вирус HBV и его концентрацию. В период заболеваемости в сыворотке присутствует белковый антиген – часть оболочки возбудителя. Именно его распознает и атакует иммунная система организма.
По концентрации антигенов и антител в сыворотке крови можно судить о степени активности возбудителя.
ПЦР дает оценку HBV на момент взятия проб. В процессе молекулярного исследования сначала расщепляется цепочка ДНК, для этого в амплификаторе сначала повышается температура, затем резко снижается. Маркеры в нужной последовательности присоединяются к ДНК – создаются копии исследуемого материала, по ним определяют концентрацию возбудителя в расчете на 1 мл.
Показания к исследованию
Качественный анализ ПЦР выявляет возбудителя. По результатам судят о стадии гепатита.
Исследования проходят:
- реципиенты донорской крови;
- больные с почечной недостаточностью, находящиеся на гемодиализе;
- инфицированные ВИЧ;
- беременные женщины;
- медицинские работники инфекционных отделений;
- лаборанты, исследующие кровь;
- больные с печеночными патологиями;
- все потенциально зараженные;
- люди, побывавшие в странах с высоким уровнем заболеваемости.
Количественный ПЦР проводится:
- если ранее был выявлен возбудитель HBV, проводится лечение;
- после положительных проб ИФА (иммуноферментного анализа);
- при печеночных заболеваниях, причиной которых бывает вирус гепатита В.
Для исследования берется венозная кровь, делается это на голодный желудок. Точность оценки зависит от правильности подготовки пациента перед исследованиями.
Виды ПЦР
Количественный и качественный методы диагностики гепатита В по сути не различаются. Они основаны на свойствах ДНК-вируса, его способности синтезировать особые белки, которых нет в организме человека. Метод полимеразной реакции с высокой долей вероятности выявляет возбудитель, имеющий сложную структуру.
В зависимости от концентрации HBsAg, HBeAg судят о стадии развития заболевания, правильности лечения. При остром гепатите они присутствуют в крови одновременно, при наличии HBeAg больной является вирусоносителем, способен заражать других. Методику ПЦР определяет врач на основании анамнеза пациента.
Количественный ПЦР на гепатит В
Показатель ПЦР количественный при гепатите B характеризует:
- интенсивность деления вируса в клетках печени;
- способность организма противостоять инфекции;
- правильность выбора противовирусных средств.
В ходе болезни неоднократно проводится анализ полимеразной цепной реакции, количество вирусов в крови постоянно меняется. После инкубационного периода возрастает уровень HBsAg. Затем появляется HBeAg – антиген, находящийся в ядре возбудителя. Когда этот антиген исчезает, вместо него появляются антитела. Это говорит о борьбе организма с возбудителем. Метод определяет вирусную нагрузку на иммунную систему.
По количественному показателю ПЦР выявляется опасность хронической формы заболевания. Установлена норма трансаминазы, при которой вирус неактивен для окружающих. Больным, состоящим на учете, исследования проводятся каждые три месяца. По вирусной нагрузке определяют степень тяжести болезни. Если она превышает допустимую в два раза, больному назначают дополнительное обследование, меняют тактику лечения.
Качественный ПЦР
Метод полимеразной реакции самый надежный для выявления возбудителя. Качественный ПЦР анализ на гепатит В с высокой точностью устанавливает факт заражения вирусом HBV. Он подтверждает или опровергает предварительный диагноз.
В 50% ДНК вирус выявляется на стадии, пока организмом не вырабатываются антитела. Иммунная система не сразу распознает чужеродные белки, они выявляются, когда размножившийся вирус покидает гепатоциты.
Уничтожая HBsAg и HBeAg, организм попутно разрушает гепатоциты. Это приводит к серьезным осложнениям. Когда HBV присутствует в крови более двух месяцев, гепатит В переходит в хроническую форму. В течение первых двух недель с вирусом бороться легче.
Расшифровка результатов ПЦР на гепатит В
Человек здоров, если возбудитель не присутствует в крови, или концентрация HBsAg ничтожна, а HBеAg отсутствует полностью. Результат в этом случае отрицательный. Только в единичных случаях при отрицательном результате выявляется заболевание, это говорит о быстром течении болезни или злокачественным ее характере. Антитела, вырабатываемые иммунной системой, нейтрализуют ДНК-вирус. Но в этом случае возможно обширное поражение печени.
Если результат HBsAg выше нормативных показателей и есть HBеAg, то дополнительно проводится количественный анализ на гепатит В, чтобы узнать, насколько активизировался возбудитель.
Что делать если при ПЦР подтвердили гепатит В?
Важно обезопасить близких:
- отдельно держать предметы личной гигиены, способные повреждать кожу и слизистые (зубную щетку, бритву, маникюрные принадлежности);
- пользоваться индивидуальным полотенцем;
- изолировать раны.
Полезно придерживаться диеты, отказаться от вредных привычек. При соблюдении всех назначений врача от вируса избавляются навсегда.
( 1 оценка, среднее 5 из 5 )
Источник
Содержание
- Виды ПЦР
- Показания для анализа
- Подготовка к ПЦР-диагностике гепатита
- Расшифровка результатов ПЦР-исследования
- Преимущества ПЦР-анализа
- Недостатки ПЦР
- Цена ПЦР-анализа на гепатит С
ПЦР (или полимеразная цепная реакция) — это введенный Кэри Муллисом (США) лабораторный способ диагностики ДНК и РНК возбудителя. Достаточно всего одной молекулы, обнаруженной в коже или биологической жидкости, чтобы высокочувствительный ПЦР-анализ выявил вирус-возбудитель.
Виды ПЦР
ПЦР-анализ крови при ХВГС бывает трех видов — качественный, количественный и анализ, определяющий генотип вируса.
Качественный ПЦР-анализ на гепатит С проходят те пациенты, у которых ИФА-анализ выявил антитела к ХВГС. Результат качественного ПЦР-анализа обозначается словами «РНК обнаружена» или «РНК не обнаружена». Выявить в крови минимальное количество возбудителя способны тест-системы, чья чувствительность составляет не менее 50 МЕ/мл. При меньшей концентрации вируса анализ может дать ложноотрицательный результат. Во избежание ошибки лаборатории, специализирующиеся на ПЦР-диагностике, необходимо оснащать тест-системами высокой чувствительности. Например, лаборатория «Инвитро» использует тестовые системы с чувствительностью от 15 МЕ/мл. Пациенты и врачи имеют право требовать от сотрудников лаборатории данные о чувствительности тестов.
Количественный ПЦР-анализ на гепатит С нужен, чтобы определить концентрацию вируса в крови (или степень виремии). О результате исследования говорят цифры. Если в 1 мл крови найдено 2 млн. МЕ, то результат выглядит следующим образом — 2×10*6 МЕ/мл. Некоторые лаборатории используют другой показатель — число копий на 1 мл крови (1 МЕ — это 4 копии РНК). Получается, что 2×10*6 МЕ/мл равняется 8×10*6 копий РНК вируса (8 млн. копий) в 1 мл крови.
При генотипировании определяется, к какому из шести генотипов принадлежит вирус. Именно генотип возбудителя влияет на клиническую картину, скорость появления осложнений и дальнейший прогноз для пациента. Правильное определение генотипа вируса дает возможность выбрать комбинацию препаратов и определить длительность курса лечения.
Рекомендуемые товары
Показания для анализа
Чтобы подтвердить наличие ВГС, назначается ПЦР-анализ, помогающий обнаружить возбудителя и начать лечение. Показания для назначения:
- У пациента обнаружены признаки воспаления печени.
- Проводятся скрининговые профилактические исследования.
- Необходимо обследовать людей, контактирующих с больными гепатитом.
- Диагностируются гепатиты смешанного происхождения, и надо определить главный возбудитель.
- Определяется уровень активности размножения возбудителя у хронических больных.
- У пациента диагностирован цирроз.
- Необходимо оценить эффективность проводимой терапии.
Подготовка к ПЦР-диагностике гепатита
Процедура проводится утром натощак, кровь берется из вены.
Пациент должен следовать следующим правилам:
- Не употреблять пищу за 10 часов до процедуры. Разрешается пить только чистую воду.
- Не курить за 4 часа до манипуляции и не употреблять спиртное за сутки до анализа.
- Избегать физических и психологических нагрузок перед процедурой.
- Не принимать лекарственные препараты в течение 2 дней перед забором крови. Если пациент по каким-либо причинам принимал лекарства, то об этом надо уведомить лаборанта (употребление отдельных препаратов вызывает ошибочно положительный результат).
Расшифровка результатов ПЦР-исследования
Расшифровка ИФА- и ПЦР-анализа — это задача для гепатолога или инфекциониста. Требуются также результаты биопсии, биохимического анализа крови и УЗИ. Расшифровать результаты ПЦР-анализа может только квалифицированный врач, который должен на их основании назначить терапию. Таблицы расшифровки вирусной нагрузки при гепатите С приводятся ниже.
Качественный анализ. Расшифровка
| Обнаружено | Пациент инфицирован, т.к. в его биологическом материале найдена РНК вируса. |
| Не обнаружено | Пациент не инфицирован, либо количество РНК вируса находится ниже границы чувствительности. |
Количественный анализ. Расшифровка
| Не обнаружено | Человек здоров. РНК вируса в биоматериале не найдена, либо ее концентрация ниже границы чувствительности. |
| До 1,8*10^2 МЕ/мл | Концентрация РНК вируса находится ниже диапазона количественного определения. В таком случае требуется осторожность при интерпретации результата. Часто необходимо провести повторное исследование. |
| До 8*10^5 МЕ/мл | Низкий уровень вирусной нагрузки при гепатите С. Как правило, снижение концентрации вируса говорит об успешном лечении. |
| Больше 8*10^5 МЕ/мл | Высокий уровень вирусной нагрузки при гепатите С. |
| Больше 2,4*10^7 МЕ/мл | Поскольку количество РНК вируса выходит за верхнюю границу диапазона количественного определения, определить уровень вирусной нагрузки нельзя. Нужен повторный тест с разведением образца крови. |
Генотипирование. Расшифровка
| Обнаружена РНК определенного генотипа | В биоматериале пациента найден вирус гепатита С, относящийся к определенному генотипу и субтипу. Результат обозначается цифрами и латинскими буквами: 1а, 2b и т.д. Существует 7 генотипов и 67 субтипов. В России из 7 генотипов встречаются первые 3. |
| Обнаружена РНК вируса гепатита С | В биоматериале пациента найдена РНК нетипичного для России генотипа вируса, поэтому требуются дополнительные исследования. |
| Не обнаружено | Человек здоров, либо в его крови очень низкая концентрация РНК вируса. |
Иногда ПЦР-анализ отрицательный, но при этом ИФА-анализ говорит о наличии антител к вирусу. Это значит, что переболевший острым гепатитом С человек смог излечиться самостоятельно. Около 20-ти случаев инфицирования при сильном сопротивлении организма инфекции заканчиваются самопроизвольным излечением.
В некоторых ситуациях результаты высокоточного ПЦР-анализа могут быть искажены:
- Нарушения температурного режима и других условий транспортировки крови в лабораторию.
- Загрязнение образца крови.
- Присутствие следов гепарина и других антикоагулянтов в крови.
- Присутствие ингибиторов в биоматериале (полимеразная цепная реакция замедляется или останавливается).
Преимущества ПЦР-анализа
Во-первых, это метод ранней диагностики, который позволяет выявить генетический материал вируса. ИФА-анализ способен определить только вырабатываемые организмом в ответ на инфекцию вещества (иммуноглобулины). С момента заражения гепатитом С до начала иммунного ответа может пройти несколько недель и даже месяцев, и в этот период ИФА-анализ неэффективен. ПЦР-анализ уже на первой неделе инфицирования дает ответ.
Второе преимущество ПЦР-анализа — низкая вероятность ошибки. При исследовании определяют характерный только для одного вида возбудителей участок генетического материала, что дает возможность исключить ложный результат. ИФА-анализ показывает наличие антител, которые выделяются против разных вирусов (перекрестные антитела).
Недостатки ПЦР
Каким бы эффективным ни было исследование, у него есть свои минусы:
- В ходе ПРЦ-исследования генетический материал возбудителей (в том числе неживых) реплицируется, а это приводит к искажению результатов. Чтобы оценить эффективность лечения с помощью ПЦР-анализа, повторное исследование проводится как минимум через 2 месяца после предыдущего. Организм пациента должен быть «очищен» от погибших вирусов.
- Тест-системы определяют часть вирусного генома, которая теоретически может принадлежать другим вирусам или микроорганизмам, следовательно, существует вероятность ложноположительного результата.
- Быстрая мутация вирусов иногда опережает способность тестовых систем определять геном возбудителя, следовательно, есть вероятность ложноотрицательного ответа.
Производители лабораторных тест-систем регулярно проводят их испытания, выясняя, как системы реагируют на перекрестные реакции или какой-либо генотип вируса.
Цена ПЦР-анализа на гепатит С
В государственных учреждениях пройти анализ можно бесплатно, требуется только направление от гепатолога или инфекциониста.
Платное исследование доступно во всех крупных городах РФ. На цену влияет тип исследования, используемое оборудование, необходимое для анализа время.
В Москве и Санкт-Петербурге качественный ПЦР-анализ на гепатит С стоит от 600 до 900 рублей, в области — от 300 до 800 рублей.
Количественный ПЦР-анализ на гепатит С стоит от 17000 до 22000 рублей, на гепатит В — от 1200 до 10000 рублей.
Чтобы получить достоверные результаты ПЦР-анализа на гепатит С, надо обращаться только в зарекомендовавшие себя лаборатории. В этом случае вопрос стоимости исследования отходит на второй план.
Источник
Вирусный гепатит В успешно лечится, если его вовремя обнаружить и правильно определить количество антител и антигенов в крови больного. С помощью иммуноферментного анализа на гепатит можно обнаружить присутствие маркеров вируса, но не могут установить точно стадию процесса.
Для количественной оценки применяют ПЦР диагностику. С помощью теста возможно посчитать количество маркеров, спрогнозировать течение болезни и вероятность излечения при помощи противовирусных препаратов.
Главное преимущество исследования — возможность обнаружить даже минимальные концентрации вируса, идентифицировать возбудителя на видовой стадии.
Диагностика гепатита В
Вирус гепатита В отличается большой контагиозностью и устойчивостью к внешним воздействиям. Он сохраняет активность в следах крови больного до нескольких недель. Поэтому каждый человек подвержен риску заражения даже при условии соблюдения профилактики.
Для диагностики заболевания назначают следующие исследования:
| Иммуноферментный анализ крови на наличие антител к ВГВ | Это быстрый и информативный тест. Его недостатком является то, что исследование только дает информацию о присутствии антител, но не уточняет их количество. |
| Биохимический анализ крови | При начавшихся изменениях в печени в крови больного будет повышен уровень билирубина, щелочной фосфатазы и снижен уровень печеночных ферментов. Но на начальной стадии показатели будут находиться в пределах нормы. |
| ПЦР (полимеразная цепная реакция) | С ее помощью восстанавливают ДНК вируса, подсчитывают количественные показатели антител, уточняют стадию заболевания. То есть разное количество антител может свидетельствовать об остром этапе или о постпрививочном иммунитете. |
Суть ПЦР метода
Родоначальником метода ПЦР (полимеразной цепной реакции) считается ученый из Норвегии Х. Клеппе. Он первый стал проводить амплификацию (восстановление) ДНК при помощи короткой цепочки ДНК, то есть синтетического праймера (своеобразной копии).
Однако, ученому не удалось реализовать свою идею. Похожие исследования сделал американский химик К.Муллис, который в 1993 был удостоен Нобелевской премии за свое изобретение. С тех пор ПЦР используют для установления отцовства, диагностики генетических болезней, обнаружения вирусов.
Суть реакции в том, что при помощи ферментов копируется определенный участок ДНК. Скопировать можно только участок, который соответствует заданным параметрам и если он есть в представленном образце. Для запуска реакции применяют следующие компоненты:
- Матричная ДНК с участком, подлежащим копированию.
- Праймеры, схожие по строению участку ДНК.
- Полимераза, то есть фермент, запускающий реакцию. Она должна быть термостабильной, то есть выдерживать перепады температур.
- Раствор с определенными параметрами, обеспечивающий прохождение реакции.
Реакция проводится в несколько этапов:
| Денатурация (прогревание) | Сначала раствор нагревают, в результате чего цепочки ДНК расходятся. |
| Стадия отжига | Раствор остужают, праймеры связываются с одноцепочечной матрицей. |
| Этап элонгации | Полимераза создает дочернюю цепь ДНК, достраиваются все фрагменты цепочки. Цепочка может расти до пределов, которые задаются количеством реагентов, затем достигает состояния плато. |
Для обнаружения гепатита в применяют два типа реакции: количественную и качественную.
Количественный ПЦР
Количественный ПЦР предполагает одновременное создание копий фрагментов ДНК и определение количества молекул. Измерение проводится после каждого этапа, то есть в режиме реального времени. Это достигается при помощи флюоресцентных зондов, которые включаются в цепочку молекул и светятся в определенный период исследования.
Данный способ применяют для обнаружения фрагментов ДНК, которые являются маркерами вируса гепатита. С помощью количественного метода удается точно выделить генотип вируса. Другими словами, подсчитывают количество копий генома ВГВ на количество клеток больного.
Количественный анализ дает ответы на следующие вопросы:
- С какой интенсивностью прогрессирует болезнь.
- Насколько эффективно проводимое лечение.
- Развилась ли резистентность к назначенным препаратам.
Также количественное измерение необходимо для диагностики хронической стадии инфекции. Если количество ДНК ниже 100 шт/мл при нормальном уровне трансаминаза, то человек является носителем вируса.
При острой фазе количество антител значительно выше.При антивирусной терапии повышение количества антител свидетельствует о развившейся устойчивости к лекарствам, это является сигналом для корректировки лечения.
Качественный ПЦР
Качественный ПЦР позволяет только установить присутствие возбудителя в крови. Если они отсутствуют, то пациент не заражен, при попадании возбудителя в кровь результат будет положительным.
Однако, с помощью качественной реакции невозможно уточнить геном вируса, этап заболевания. Поэтому для диагностики ВГВ проводят как количественное, так и качественное измерение.
Подготовка к обследованию
Для проведения анализа методом полимеразной реакции необходима венозная кровь. Это необходимо сделать утром на голодный желудок.
Пациенту следует правильно подготовиться к исследованию:
- За 10 часов отказаться от пищи, можно пить только чистую воду.
- Накануне прекратить прием алкоголя, за 4 часа не курить.
- Перед обследованием стоит избегать физических и эмоциональных стрессов.
- За 2 суток перестать употреблять лекарства, если это невозможно, то необходимо предупредить лаборанта. Некоторые препараты оказывают влияние на конечный результат.
Интерпретация данных
Интерпретировать данные качественного измерения несложно. Он дает либо положительный, либо отрицательный ответ.
При количественной реакции оценить полученные показатели можно в зависимости от числа копий ДНК. Единицей измерения является копий/мл.
Расшифровываются данные следующим образом:
- Если количество ДНК ВГВ менее 90, то инфекция отсутствует. У пациента развился поствакцинальный иммунитет, либо он излечился от болезни.
- При числе копий 2х100 говорят о носительстве вируса.
- Количество 2х106 свидетельствует о хронической стадии болезни.
- При ДНК более 2х109 пациент болен острой стадией гепатита.
Ошибочные результаты
Преимущества метода диагностики с помощью полимеразных реакцийи заключаются в следующем:
- Прямое обнаружение возбудителей. В отличие от него, метод ИФА дает информацию о присутствии антител к вирусу.
- Специфичность. То есть копируется именно участок ДНК, который имеется в образце биоматериала.
- Повышенная чувствительность. Метод может обнаружить даже единичные фрагменты клеток.
- Диагностика болезней в острой и в скрытой стадии. То есть, можно диагностировать болезнь на этапе доклинических проявлений.
У метода есть недостатки, которые приводят к ложным результатам. Самый существенный недостаток — вероятность загрязнения материала. Основным источником загрязнения являются плохо обработанные пробирки, руки лаборанта, реактивы.
В кровь может попасть часть ДНК от предыдущей реакции. Поэтому к лабораториям предъявляются повышенные санитарные требования: раздельные помещения, пластиковые пробирки, обработка лабораторий ультрафиолетом и т. д.
Ложноотрицательные результаты могут быть следствием сниженной чувствительности реакции. Это происходит в следующих ситуациях:
- пациент принимает лекарственные препараты, например, антикоагулянты;
- человек перед анализом перенес физическое напряжение (занятия спортом, тяжелая работа);
- заражение произошло недавно.
Если у пациента есть высокая вероятность инфицирования, а результат исследования отрицательный, ему необходимо повторное обследование.
Заключение
Метод полимеразной цепной реакции является основным и самым информативным для диагностики ВГВ. Он позволяет не просто установить носительство инфекции, но и уточнить этап заболевания, оценить результаты лечения.
Для более точного диагноза применяют качественное и количественное измерение. К недостаткам способа можно отнести вероятность загрязнения, снижение чувствительности и довольно высокую цену.
Для того, чтобы результаты были наиболее достоверными, следует правильно подготовиться к исследованию и проводить его в клинике с соответствующей лицензией и хорошей репутацией.
Смотрите видео о ПЦР:
Гепатолог, Гастроэнтеролог, Диетолог
Светлана Владимировна принимает пациентов с заболеваниями печени и ЖКТ различной степени тяжести. Благодаря ее знаниями в диетологии, на основании диагностики проводит полный комплекс терапии внутрибрюшных органов.Другие авторы
Комментарии для сайта Cackle
Источник
